正交試驗優(yōu)選扶陽軟堅清脈方的提取工藝

常錦明 宋清宏 曹燁民 魏 莉

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海，201203;2上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海，200031;3上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管科，上海，200082)

扶陽軟堅清脈方應(yīng)用奚九一教授“因痰致瘀”觀點的經(jīng)驗方[1]，由制附子、肉桂、豨薟草、垂盆草、干姜等9味藥物組成，主治肢體動脈硬化閉塞，是益氣溫陽、健脾化飲的代表方。肢體動脈硬化閉塞癥(ASO)是一種肢體慢性或急性缺血的疾病[2]。隨著社會老齡化，我國ASO患者在逐年增加，其死亡率和病殘率均較高，位居周圍血管病的首位[3]。本方以附子、肉桂回陽救逆[4]為君藥，以昆布、豨薟草祛風(fēng)軟堅為臣藥，以垂盆草、煅牡蠣、蒲黃化痰祛瘀為佐藥，以干姜、炙甘草溫中調(diào)和為使藥，臨床用于治療多種心血管疾病，對肢體動脈硬化閉塞癥有顯著療效，能有效改善肢體動脈硬化閉塞癥的臨床缺血癥狀和體征，有改善肢體動脈供血的作用[5]。本實驗根據(jù)每味藥君臣佐使的藥效關(guān)系和主要藥效成分，以奇壬醇、肉桂酸含量[6]及干膏得率為考察指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)選提取工藝，為制劑規(guī)范化加工提供技術(shù)參數(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀;電子分析天平(Sartorius CPA225D);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI B49);L－120042超聲清洗儀(100 w，50 Hz，江蘇昆山力波超聲設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 奇壬醇對照品:購于中國藥品生物制品檢定所(批號:111726－200601);肉桂酸對照品:購于中國藥品生物制品檢定所(批號:110786－200503);制附子、肉桂、豨薟草、垂盆草、干姜、炙甘草、生蒲黃、昆布、煅牡蠣購于上海康橋中藥飲片有限公司(經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國藥典》2010年版規(guī)定)。

1.3 試劑 KromasilC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm):大連依利特分析儀器有限司;甲醇為色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號:40064292);乙腈為色譜純:上海豪申化學(xué)試劑有限公司(批號:40064193);磷酸為色譜純:上海豪申化學(xué)試劑有限公司(批號:20100315);水為純化水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 奇壬醇和肉桂酸含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取奇壬醇和肉桂酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶液制成1 mL含226.8 μg 和164.8 μg 的對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取藥材，根據(jù)正交試驗表提取得水提液9組，均濃縮至200 mL以下，定容與250 mL的容量瓶中，分別精密移取20 mL放入真空干燥箱中，70℃干燥至恒重，各移取所得浸膏粉于50 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋，超聲30 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按處方比例除去豨薟草和肉桂稱取藥材，再按“2.1.2”供試品溶液制備的方法分別制得不含豨薟草和肉桂的陰性對照溶液。

2.1.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》及有關(guān)文獻(xiàn)文獻(xiàn)[7－10]確定奇壬醇和肉桂酸含量測定的色譜條件:色譜柱為Kromasil C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動相分別為乙腈∶甲醇∶水(23∶18∶59)和乙腈∶0.1% 磷酸(35∶65);流速為1.0 mL/min;檢測波長為215 nm和285 nm;柱溫:25℃;理論板數(shù)按奇壬醇和肉桂酸分別不得低于5 000和3 000。

2.1.5 專屬性試驗 分別精密吸取奇壬醇和肉桂酸的對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，進(jìn)樣量分別為20 μL和10 μL，兩者在上述色譜條件下，峰型良好，陰性樣品無干擾，見圖1至圖6。

圖1 奇壬醇對照品的HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

圖3 陰性樣品的HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取奇壬醇和肉桂酸的對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mL 于 10 mL的容量瓶中，加70%的甲醇定容，搖勻，分別得到濃度梯度為11.34～68.04 μg/mL 和1.64－9.89 μg/mL的對照品溶液。按照上述色譜條件進(jìn)行測定，分別以對照品的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以各自峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程為:Y=16 312X－6.689，r=0.999 8 和 Y=72 470X，r=0.999 8，在11.34 mg/mL－ 68.04 μg/mL 和 1.65 μL/mL－ 9.89 μL/mL的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖4 肉桂酸對照品的HPLC色譜圖

圖5 供試品的HPLC色譜圖

圖6 陰性樣品的HPLC色譜圖

2.3 精密度試驗 分別精密吸取同一濃度奇壬醇和肉桂酸對照品溶液，按照上述色譜條件分別連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測定各自峰面積，結(jié)果該方法測得6次峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard deviation，RSD)分別為:RSD=0.17%和0.86%，表明奇壬醇和肉桂酸的含測方法精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗 取同一批號處方量藥材6份，按“2.1.2”供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定各自峰面積，RSD分別為:1.83%和0.30%，表明含測方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取處方量取藥材，按“2.1.2”供試品溶液方法制備，精密吸取該供試品溶液，分別在0、4、8、10、12、24 h 內(nèi)不同的時間點進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積，結(jié)果該方法測得供試品中奇壬醇和肉桂酸峰面積RSD分別為:1.43%和0.36%，表明供試品溶液中的奇壬醇和肉桂酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗 精密稱定3個不同比例(80%、100%、120%)已知含量的樣品9份，分別加入一定量的奇壬醇和肉桂酸對照品溶液，按加樣回收試驗計算回收率，結(jié)果平均加樣回收率分別為:98.10%和98.47%，RSD分別為:0.93%和1.01%，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確度，見表1和表2。

表1 奇壬醇回收率試驗結(jié)果

表2 肉桂酸回收率試驗結(jié)果

2.7 供試品中奇壬醇和肉桂酸的含量測定 取“2.1.2”項下供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測定其峰面積，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算奇壬醇和肉桂酸的含量。

2.8 得膏率的測定 取按L9(34)正交試驗表提取所得水提液，濃縮至200 mL以下，定容與250 mL的容量瓶中，精密移取20 mL于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，放入70℃的真空干燥箱干燥至恒重，取出置干燥器中，冷卻30 min后，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻，稱定質(zhì)量，至連續(xù)2次稱質(zhì)量的差異不超過3 mg為止，計算干膏得率。

2.9 提取工藝研究

2.9.1 因素水平的確設(shè)定和正交試驗結(jié)果 本方長期用于治療肢體動脈硬化閉塞，效果良好，臨床用水煎服，因此本實驗提取溶劑為水。根據(jù)附子和煅牡蠣用法[11]，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[12－15]取日處方量制附子、煅牡蠣加10倍量水先煎2 h，收集煎液，殘渣與處方量肉桂、豨薟草、垂盆草、干姜等藥材合并，以奇壬醇、肉桂酸的含量及得膏率為綜合評價指標(biāo)，按L9(34)正交試驗表進(jìn)行試驗，考察加水量(A)、提取時間(B)、浸泡時間(C)、提取次數(shù)(D)對提取結(jié)果的影響，優(yōu)選的最佳工藝，因素水平見表3。在根據(jù)王暉等對多指標(biāo)綜合評價方法研究及權(quán)重系數(shù)如何選擇和確立[16]的基礎(chǔ)上，結(jié)合自身試驗的特點和考察指標(biāo)間的關(guān)系，合理、科學(xué)地設(shè)置各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為，肉桂酸∶奇壬醇∶得膏率(0.4∶0.3∶0.3)(綜合評分=奇壬醇的含量×0.3+肉桂酸的含量×0.4+得膏率×0.3)，結(jié)果見表4。

表3 因素水平表

表4 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

2.9.2 正交試驗結(jié)果的方差分析 對以上正交數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，直觀分析結(jié)果表明，影響水提工藝程度的四個因素的次序為:D＞A＞C＞B，最佳提取工藝為:D3A3C3B2。方差分析結(jié)果表明，D因素對水提工藝有顯著的影響，A、B、C因素?zé)o顯著性差異，但綜合考慮到節(jié)約成本、方便生產(chǎn)等各方面原因，扶陽軟堅清脈方的最佳提取工藝為:D3A1C2B2，即加8倍的水，浸泡半個小時，提取3次，每次提取2 h，結(jié)果見表5。

表5 方差分析結(jié)果表

2.9.3 驗證試驗 為考察上述優(yōu)選提取工藝的穩(wěn)定性，按該工藝條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(n=3)，分別測定奇壬醇、肉桂酸的含量和得膏率。試驗結(jié)果表明，該工藝合理可行，重現(xiàn)性較好，試驗結(jié)果見表6。

表6 驗證試驗

3 討論

軟堅清脈方處方中藥味較多，并且所含藥味活性成分比較復(fù)雜，試驗以多個有效成分和指標(biāo)進(jìn)行考察，優(yōu)選最出佳提取工藝，確保了新藥的臨床療效。本試驗用多指標(biāo)進(jìn)行正交試驗工藝優(yōu)選時，首先要解決指標(biāo)結(jié)果間是否矛盾和兩個指標(biāo)成分含量和得膏率之間量綱不一致的問題，為此，采用多指標(biāo)綜合評分法，設(shè)置各個指標(biāo)結(jié)果的權(quán)重系數(shù)，綜合評分后再進(jìn)行統(tǒng)計分析，這樣優(yōu)選出的工藝條件更加合理。從肉桂中可分離出肉桂醛和肉桂酸等藥效成分，但由于肉桂醛在提取過程中極易轉(zhuǎn)化成肉桂酸，很不穩(wěn)定，而肉桂酸穩(wěn)定可控，為此本試驗選用肉桂酸做指標(biāo)藥效檢測成分。在檢測奇壬醇的過程中，試驗曾選用過的流動相還有乙腈∶水(25∶75)，乙腈∶甲醇∶水(18∶18∶64)，乙腈∶甲醇∶水(20∶18∶62)結(jié)果均不太理想，峰得不到較好的分離，且拖尾比較嚴(yán)重，采用本試驗方法成分分離效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度較高。

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