miRNA“封閉海綿”的構(gòu)建與應用

李 鳳綜述，李 智審校

(同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海200072)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長約20～24個核苷酸的小分子非編碼RNA，其可以通過與特定mRNA結(jié)合或調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程來調(diào)控基因的表達［1］。越來越多的數(shù)據(jù)顯示，miRNA在多種人類疾病中表達異常。然而，每種miRNA在不同環(huán)境中的特定功能還尚待發(fā)現(xiàn)。研究其功能的最好方法就是使關(guān)注的miRNA失去功能，“封閉海綿”(miRNA sponge)就是新近發(fā)現(xiàn)的具有封閉miRNA功能的物質(zhì)。

一、miRNA與海綿

1.miRNA的概念及特征 miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為20～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其在體內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達調(diào)控。從發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有1 000余種miRNA在人類中鑒定出來［2］。miRNA首先由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成長達數(shù)百個或數(shù)千個堿基大小的初始轉(zhuǎn)錄子(pri-miRNAs)。初始轉(zhuǎn)錄子被含有Drosha(核酸內(nèi)切酶III)和雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha的復合物剪切為60～70個的miRNA前體(premiRNA)［3］。miRNA前體由小分子單體 G蛋白Ran-GTP依賴的轉(zhuǎn)運蛋白exportin-5運輸至細胞質(zhì)，被Dicer酶(核酸內(nèi)切酶)剪切成約22個核苷酸的雙鏈miRNA［4］。雙鏈miRNA被解旋酶解螺旋后，1條鏈被降解，另1條成為5'端為磷酸基團、3'端為羥基的成熟miRNA。

miRNA雖不編碼蛋白，但通過對特定mRNA的降解或沉默來實現(xiàn)對特定基因的調(diào)控。計算證明，miRNA在一般情況下可以調(diào)控上百個基因。然而，每種miRNA在不同環(huán)境中的特定功能仍不清楚［5］。

2.“封閉海綿”的產(chǎn)生 研究miRNA功能的最好方法就是令待研究的miRNA失去功能。目前來講有3種方法:基因敲除、寡核苷酸抑制劑、“封閉海綿”［6-8］。每種方法都各有優(yōu)劣。寡核苷酸抑制劑主要用于短期實驗;基因敲除雖可用于長期體內(nèi)研究，但有相當數(shù)目miRNA位于蛋白編碼區(qū)內(nèi)或在miRNA簇中，所以基因敲除無論在時間、花費還是技術(shù)上都面臨挑戰(zhàn);而包含多個微小RNA結(jié)合位點的“封閉海綿”作為一種可以替代基因敲除方法脫穎而出［9］。

“封閉海綿”含有多個高親和力的miRNA的反義結(jié)合位點［23］。作為一個合成基因可以與miRNA的3'UTR區(qū)(Untranslated Regions，非翻譯區(qū))結(jié)合達到封閉特定miRNA功能。當“封閉海綿”在細胞內(nèi)高表達時，它可以抑制有相同種子序列(miRNA中2～7個核苷酸決定著對靶基因識別的特異性)的miRNA家族活性?？梢詫⒕幋amiRNA基因徹底沉默［10］，保證特定miRNA喪失活性。

二、“封閉海綿”的構(gòu)建

第一個內(nèi)源性的“封閉海綿”是在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其可受環(huán)境因素介導miRNA表達的強弱［11］。2007年，Margaret S Ebert 等［12］將含有miRNA結(jié)合位點的序列插入到由巨細胞病毒啟動的編碼報告基因GFP3'UTR區(qū)，制備出第一個人工合成的“封閉海綿”，為miRNA研究開辟了1條新途徑。這段序列在第9～12位上有個凸出部位能阻止RNA干擾和“封閉海綿”降解，其也可以與miRNA核心區(qū)完美結(jié)合達到對miRNA功能的完全封閉。具有4個核苷酸組成的中央凸起的海綿比擁有完美序列反義結(jié)合位點的海綿之所以在封閉功能上更有效是因為后者會被內(nèi)源性AGO2的裂解活動影響以至于產(chǎn)生海綿體的降解從而減弱封閉效果［24］。見圖1、圖2。

miRNA“封閉海綿”封閉效率不僅依賴結(jié)合位點間的親和力還依靠海綿與miRNA間比例關(guān)系。為了使封閉效果最大化，應該使用所屬細胞類型最強的促進劑，比如哺乳細胞中巨細胞啟動子［12］。“封閉海綿”中凸起部位與促進劑合理選擇構(gòu)建出經(jīng)典的miRNA海綿。

經(jīng)典“封閉海綿”包括4～10個不相鄰結(jié)合位點，位于RNA不編碼的非結(jié)構(gòu)區(qū)，之間由不等量核苷酸分開。增加位點的數(shù)目可以減少邊際效應，但伴隨結(jié)合位點增加，也同時增加封閉RNA降解幾率［10］。在“封閉海綿”上人為制造突變可以導致一些部位錯配，從而減少復制期間重組以及與其他調(diào)節(jié)因子靶基因位點結(jié)合的可能性。但是在構(gòu)建海綿的過程中，只有一部分反義結(jié)合位點可以插入到載體中，目前尚未能夠?qū)⑺袃?nèi)源性 miRNA 封閉［23］。

圖1 miR-21“封閉海綿”序列圖

圖2 RISC組成

三、“封閉海綿”應用與缺陷

1.“封閉海綿”應用 miRNA海綿的直接應用是通過瞬時轉(zhuǎn)染來獲得所需的細胞類型。轉(zhuǎn)染方法具有很大靈活性，轉(zhuǎn)染時可選擇不同啟動子、載體、報告基因和miRNA靶基因結(jié)合位點來監(jiān)測不同的細胞表型。最常用載體是質(zhì)粒［13］，也有人采用反轉(zhuǎn)錄病毒［14］、慢病毒［15-16］進行轉(zhuǎn)染。最常用的報告基因是綠色熒光蛋白報告基因［17-18］，還可以采用mcherry熒光蛋白基因或者螢光素酶報告基因。一般情況下，在轉(zhuǎn)染海綿24～48 h后對細胞進行分析和靶基因驗證。目前為止，獨立的miRNA例如miR-155或大種子家族let-7都可用海綿成功封閉［10-11］。

如果封閉成功，“封閉海綿”會導致miRNA水平特異性降低，在某些情況下Northern blot也無法檢測到miRNA［19］。這表明miRNA靶基因相互作用激發(fā)了miRNA降解。在果蠅和哺乳動物細胞內(nèi)，當“封閉海綿”結(jié)合位點與miRNA的3'末端有充分結(jié)合時可加速miRNA核酸外切酶對miRNA的作用［20］。當構(gòu)建的海綿有充足結(jié)合位點并含有可阻止“封閉海綿”本身降解的凸起時，上述情況更容易出現(xiàn)。另一個理想情況是在海綿中增加靶基因位點而不會導致miRNA表達水平上調(diào)。

早期細胞內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)染海綿結(jié)果比較符合人們的預期效果，但由質(zhì)粒介導的海綿瞬時轉(zhuǎn)染只能滿足對特定miRNA細胞水平監(jiān)測，有時研究需要在體內(nèi)長期穩(wěn)定地封閉特定miRNA功能。Gentner等［21］嘗試用慢病毒載體把海綿序列穩(wěn)定地過表達在細胞內(nèi)并且成功地誘導出封閉特定miRNA功能的小鼠。Bhalala［25］通過封閉 miR-21功能的小鼠研究得出miR-21在脊髓損傷中有著重要的調(diào)節(jié)功能。miR-574-5p的封閉質(zhì)粒幫助Li發(fā)現(xiàn)了其對TLR9的調(diào)控作用更深一步的揭露了miRNA與Toll樣受體在腫瘤生物學之間的關(guān)聯(lián)［26］。Wu 等［27］構(gòu)建了含有 miR-20a 海綿序列的質(zhì)粒并用病毒載體將其表達在HEK-293T細胞中以此獲得了穩(wěn)定的細胞株系Jurkat-S。

2.“封閉海綿”應用中的缺陷 盡管miRNA海綿有很多優(yōu)點，但其在不同環(huán)境中仍會表現(xiàn)出對miRNA程度不同的抑制。比如在miRNA濃度很高情況下，想要完全封閉其功能就需要很高的海綿劑量，而這個劑量可能難以達到，即該miRNA的封閉模型無法達到預期效果。換一個角度來講，如果細胞中miRNA內(nèi)源性靶基因很多，游離的miRNA就很少［22］，這時則僅需要很少劑量海綿就能達到很好的封閉效果。

如果轉(zhuǎn)入的海綿基因表達量很高(比如攜帶GFP報告基因)而又不確定其是否產(chǎn)生靶基因之外的效應時除了應在“封閉海綿”處理組與空載組間進行基因水平的對比，同時應與正常細胞組進行對比［10］。

確定轉(zhuǎn)入的海綿是否能成功抑制目的miRNA比驗證是否完整去除基因中成熟miRNA更具挑戰(zhàn)性［7］。海綿效應可以通過驗證已知靶基因的報告基因來檢測，通常情況下采用融合在miRNA結(jié)合位點的熒光素酶報告基因或者一個已經(jīng)確定的靶基因3'UTR來確定。在miRNA海綿抑制情況下熒光素酶報告基因表達水平明顯降低［12］。但是由于報告基因受種子家族所有成員調(diào)控，所以這種情況下很難確定在種子家族不同成員中是否有相同抑制水平。

四、結(jié)語與展望

“封閉海綿”的發(fā)現(xiàn)為我們提供了研究miRNA功能的新方法，幫助我們在動植物及病毒中探索調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平新的未知角色［8］。隨著越來越多非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)，它們的生物學功能有待驗證，尤其是與miRNA存在的潛在關(guān)系。

綜上所述，“封閉海綿”應用有著廣闊前景，但由于還存在部分缺陷，所以對“封閉海綿”研究仍在不斷繼續(xù)和完善。

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