采用可視化方法通透性處理大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)海藻糖合成酶*

崔懷言，江凌，，張文婧，唐飛，徐嫻，李霜，黃和

1(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京，210009)

2(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇南京，210009)

海藻糖(Trehalose)，是一種由葡萄糖分子以α，α-1，1-糖苷鍵相連而成的非還原性二糖［1］。由于海藻糖甜度低、性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)于生物大分子(生物膜、蛋白質(zhì)、DNA)具有良好的非特異性保護(hù)作用，因此，該雙糖被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等精細(xì)化學(xué)品領(lǐng)域［2］。海藻糖生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法和酶合成法，而實(shí)際生產(chǎn)中多采用基因工程技術(shù)獲得高效率酶的表達(dá)系統(tǒng)。其中利用海藻糖合成酶以麥芽糖為原料的一步酶法生產(chǎn)海藻糖的路線由于工藝簡(jiǎn)單、易于調(diào)控等優(yōu)勢(shì)，成為未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的趨勢(shì)［3－4］。

海藻糖合成酶屬胞內(nèi)酶，傳統(tǒng)提取工藝通常先將細(xì)胞破碎，經(jīng)逐級(jí)分離純化后才可使用，酶活損失較大，且操作復(fù)雜，設(shè)備投資大，制約了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用［5］。而采用通透性處理細(xì)胞技術(shù)，在不破壞細(xì)胞整體內(nèi)部有機(jī)結(jié)構(gòu)的前提下改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，使得小分子底物能夠自由進(jìn)出細(xì)胞膜的技術(shù)則有望克服上述缺點(diǎn)［6］。薛璐等采用甲苯和EDTA對(duì)惡臭假單胞桿菌H76菌株進(jìn)行了滲透處理，所得通透性細(xì)胞海藻糖合酶酶活高出未處理細(xì)胞的100倍以上［7］。張峻等系統(tǒng)對(duì)比了甲苯、氯仿、乙醇、吐溫、溶菌酶等試劑對(duì)亞棲熱菌CBS-01菌體細(xì)胞的滲透效果，最終確定了以2%的甲苯為滲透劑制備通透性細(xì)胞海藻糖合成酶的工藝路線［8］。但由于甲苯、氯仿等化學(xué)試劑對(duì)人體有毒害作用，存在食品安全隱患;處理細(xì)胞過(guò)程中易造成環(huán)境污染，同時(shí)也增加了海藻糖后續(xù)分離的難度，大大限制了化學(xué)通透性試劑在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

硫酸粘桿菌素是一種具有抗菌活性的生物表面活性劑，最早在桿屬多粘芽肥桿菌變種粘菌素(Bacillus polymyxa var.colistinus)的培養(yǎng)基中被發(fā)現(xiàn)，對(duì)革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，作為飼料添加劑在飼料工業(yè)中已被廣泛采用。研究表明，其抗菌機(jī)制主要是與細(xì)菌胞漿膜中脂蛋白的游離的磷酸酯鹽相互作用，使胞漿膜的表面張力降低和通透性增加，進(jìn)而使胞內(nèi)成分特別是嘌呤嘧啶從細(xì)胞原漿中逃逸，以導(dǎo)致細(xì)菌死亡［9］。本研究首次選用硫酸粘桿菌素作為通透性試劑處理大腸桿菌細(xì)胞，對(duì)其處理大腸桿菌細(xì)胞的濃度、溫度和時(shí)間進(jìn)行單因素分析;進(jìn)而，采用一種新的工藝條件優(yōu)化方法——可視化優(yōu)化方法［10－11］，對(duì)通透性處理大腸桿菌的制備工藝條件進(jìn)行分析、處理，預(yù)測(cè)出優(yōu)化的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:重組大腸桿菌 BL21(Escherichia coli)菌株，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［4］。

加氨芐的LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，氨芐抗生素0.1 g/L。

平板加氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，氨芐抗生素0.1 g/L，瓊脂20 g/L。

主要試劑:硫酸粘桿菌素購(gòu)于Ruibio公司，液相分析用色譜純麥芽糖、海藻糖、葡萄糖購(gòu)于Sigma公司，分析純麥芽糖購(gòu)于中國(guó)惠興生物化學(xué)試劑有限公司。

主要設(shè)備:高效液相色譜儀 UltiMate3000，美國(guó)Dionex公司;恒溫?fù)u床HYL-A，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;低溫高速離心機(jī)3-30K，德國(guó)Sigma公司;超聲破碎儀GA88-II，無(wú)錫上佳生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合成酶

在37℃，200 r/min條件下培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21，培養(yǎng)細(xì)胞濃度至OD6000.6～0.8加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，終濃度為 0.8 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間 8 h［4］。

1.2.2 通透性大腸桿菌的制備

發(fā)酵結(jié)束后，在6 000 r/min離心10 min后棄上清液，用0.04 mol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸洗滌2次，離心后得大腸桿菌濕菌體，加入硫酸粘桿菌素進(jìn)行通透性處理，在200 r/min條件下對(duì)硫酸粘桿菌素濃度、處理時(shí)間、處理溫度單因素處理后在6 000 r/min離心10 min后棄上清液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，并1/2體積重懸，固定細(xì)胞菌懸液濃度為10%。此細(xì)胞懸浮液可用于海藻糖合成。

1.2.3 酶活測(cè)定

15 mL的通透性處理的細(xì)胞懸浮液與50 mL的30%(W/V)麥芽糖底物，在25℃，200 r/min條件下反應(yīng)30 min?；旌弦河诜兴〖訜?0 min終止酶反應(yīng)。待其冷卻后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定生成的海藻糖含量。

酶活力單位定義:在25℃，l min生成l nmoL海藻糖所需的海藻糖合酶的量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 海藻糖含量的測(cè)定

使用高效液相色譜法測(cè)定樣品中海藻糖的含量。

流動(dòng)相為 V(乙腈)∶V(水)=75∶25;流速:0.6 mL/min;層析柱選擇氨基柱(柱溫35℃);選用視差折光檢測(cè)器。

1.2.5 智能可視化軟件優(yōu)化

采用可視化優(yōu)化方法對(duì)海藻糖制備工藝條件進(jìn)行分析處理，預(yù)測(cè)出最佳的工藝條件。可視化優(yōu)化的基本原理如圖1所示。

圖1 可視化優(yōu)化方法基本原理圖Fig.1 Principles of visual optimization method

通過(guò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)原理將樣本數(shù)據(jù)多維空間面貌特征維映射到二維平面上，運(yùn)用 MATLAB軟件編寫(xiě)程序語(yǔ)言產(chǎn)生目標(biāo)函數(shù)等值線，然后從映射平面圖中找出滿足工藝條件的優(yōu)化點(diǎn)或優(yōu)化方向，并通過(guò)逆映射算法把平面上定出的優(yōu)化點(diǎn)逆映射到多維空間用原始變量表示，從而預(yù)測(cè)出優(yōu)化工藝條件［12－13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 通透性處理大腸桿菌實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 通透性試劑的最適濃度

在細(xì)胞懸液中加入硫酸粘桿菌素，使得最終質(zhì)量濃度分別達(dá)到1.0、1.2、1.5、1.7、2.0 g/L，在25 ℃條件下反應(yīng)60 min，測(cè)定細(xì)胞懸浮液中海藻糖合成酶的活性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 硫酸粘桿菌素質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞通透性的影響Fig.2 Effects of colistin sulfate concentrations on cell permeability

由圖2可知，硫酸粘桿菌素濃度的增加，使得大腸桿菌細(xì)胞通透性同步增加，利于底物小分子進(jìn)入胞內(nèi)參與酶催化反應(yīng)，當(dāng)濃度達(dá)到1.5 g/L時(shí)，檢測(cè)酶活達(dá)到最大值。但是，隨著硫酸粘桿菌素濃度的進(jìn)一步增加，檢測(cè)酶活反而迅速下降。由于硫酸粘桿菌素能夠通過(guò)自身所帶正電荷與細(xì)菌胞漿膜磷脂分子上的負(fù)電荷形成靜電吸附，結(jié)合并進(jìn)入質(zhì)膜中，通過(guò)其分子間的相互位移而聚合形成跨膜離子通道，擾亂質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排列秩序。硫酸粘桿菌素添加濃度越高，細(xì)胞膜的有序結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重，最終致使菌體溶解，包括海藻糖合成酶在內(nèi)的胞內(nèi)物外溢，從而使得檢測(cè)酶活急劇降低［9］。

2.1.2 通透性處理的最適時(shí)間

選取1.5 g/L硫酸粘桿菌素在25℃條件下處理大腸桿菌細(xì)胞，處理時(shí)間分別為30、60、90、120 min，測(cè)定細(xì)胞懸浮液中海藻糖合成酶的活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 硫酸粘桿菌素處理細(xì)胞時(shí)間對(duì)細(xì)胞通透性的影響Fig.3 Effects of colistin sulfate processing time on cell permeability

由圖3可見(jiàn)，在處理時(shí)間少于60 min時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，細(xì)胞通透性程度加劇，使得檢測(cè)到的酶活提高，在60 min時(shí)達(dá)到最高值，隨后，隨著處理時(shí)間的增加，可檢測(cè)到的酶活急劇下降?？赡茉蚴?，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，硫酸粘桿菌素與細(xì)胞膜表面形成的離子通道激增，由于滲透壓的作用使得水分子進(jìn)入胞內(nèi)，細(xì)胞溶脹，部分海藻糖合成酶從細(xì)胞中釋放出來(lái)，從而使得檢測(cè)到的酶活下降［14］。

2.1.3 通透性處理的最適溫度

選取1.5 g/L硫酸粘桿菌素處理大腸桿菌細(xì)胞60 min，處理溫度分別是 25、28、30、33、35 ℃，測(cè)定細(xì)胞懸浮液中海藻糖合成酶的活性，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，隨著處理溫度的增加，硫酸粘桿菌素的處理效果迅速增強(qiáng)，透性化程度明顯，在溫度達(dá)到30℃時(shí)透性化程度最佳，隨后隨著溫度的增加，酶活逐漸降低，因?yàn)榇嗣冈?5～55℃之間保持較高的催化活性［4］，所以可能原因是溫度增加使得細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)加速位移，硫酸粘桿菌素能夠較容易進(jìn)入質(zhì)膜形成離子通道，導(dǎo)致離子通道有所增加，少量酶從細(xì)胞中釋放出來(lái)［14］。

2.2 通透性細(xì)胞海藻糖合成酶的反應(yīng)工藝條件優(yōu)化

圖4 硫酸粘桿菌素處理細(xì)胞的溫度對(duì)細(xì)胞通透性的影響Fig.4 Effects of colistin sulfate processing temperature on cell permeability

2.2.1 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定濃度、時(shí)間、溫度3個(gè)因素，采用正交表L9(33)對(duì)這3個(gè)因數(shù)進(jìn)行綜合考察。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)工藝;硫酸粘桿菌素濃度1.5g/L，處理時(shí)間60 min，處理溫度是35℃。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 1 Results of orthogonal experiment

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析表明，本實(shí)驗(yàn)所選用的因素對(duì)海藻糖的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率有顯著影響，各因素間差異顯著。由極差分析可知，各因素對(duì)海藻糖產(chǎn)率影響的主次順序?yàn)榱蛩嵴硹U菌素濃度＞處理時(shí)間＞處理溫度。處理溫度影響最小，與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

2.2.2 函數(shù)擬合結(jié)果

利用可視化優(yōu)化軟件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖5是目標(biāo)函數(shù)經(jīng)過(guò)100次迭代擬合計(jì)算后產(chǎn)生的擬合曲線圖。從圖5中可知，其逼近能力很強(qiáng)，除少數(shù)幾個(gè)點(diǎn)稍微有些偏差以外，其余的點(diǎn)幾乎與原始點(diǎn)重合。

圖5 函數(shù)擬合圖Fig.5 Function fitting figure

表2 可視化優(yōu)化方法的優(yōu)化結(jié)果Table 2 The optimization results of visual optimization method

2.2.3 產(chǎn)生目標(biāo)函數(shù)等值線

可視化優(yōu)化結(jié)果如圖6所示，標(biāo)號(hào)為1～9的9個(gè)點(diǎn)為每次實(shí)驗(yàn)在映射圖上所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)，黑色實(shí)線為各組實(shí)驗(yàn)酶活的等值線。根據(jù)逆映射算法預(yù)測(cè)出優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)操作點(diǎn)，其最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為:以1.42 g/L的硫酸粘桿菌素為滲透劑，35℃滲透處理72 min。預(yù)測(cè)酶活可達(dá)達(dá)7 734.32 U/mL。實(shí)際操作驗(yàn)證以1.40 g/L的硫酸粘桿菌素為滲透劑，35℃滲透處理72 min，酶活可達(dá)到7 425.13 U/mL?？梢暬瘍?yōu)化軟件預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果基本相符。此時(shí)獲得的海藻糖合成酶酶活是傳統(tǒng)超聲破碎法制備的酶活的2.09倍(7 425.32 U/mL、3 552.13 U/mL)。

2.3 通透性細(xì)胞重復(fù)使用批次考察

為了考察通透性細(xì)胞胞內(nèi)海藻糖合成酶酶活的

圖6 通透性細(xì)胞制備工藝降維映射平面圖Fig.6 Dimension reduction map of the permeable cell preparation technology

圖7 通透性細(xì)胞使用批次考察Fig.7 The using batch of the permeable cells

按優(yōu)化后方法得到的通透性細(xì)胞進(jìn)行了16批次的酶催化反應(yīng)(共192 h)，海藻糖合成酶的轉(zhuǎn)化率基本保持穩(wěn)中略降的走勢(shì)，16批次后仍保留65.12%的較高轉(zhuǎn)化率。

3 結(jié)論

細(xì)胞經(jīng)透性化處理后，雖改變胞漿膜的通透性，但細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)完整，底物既能進(jìn)入細(xì)胞，又保證了胞內(nèi)酶催化作用的充分發(fā)揮，同時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)酶還具有一定的保護(hù)作用。本文選取生物表面活性劑硫酸粘桿菌素為透性化試劑，并采用可視化優(yōu)化方法對(duì)硫酸粘桿菌素透性化處理大腸桿菌制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。由于硫酸粘桿菌素可生物降解，不會(huì)造成環(huán)境污染，獲得的透性化細(xì)胞擁有較高酶活，反復(fù)使用16批后海藻糖的轉(zhuǎn)化率維持在65%以上，顯示了良好的應(yīng)用前景，給海藻糖低成本、高效率的工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)辟出一條新工藝路徑。

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