肝細(xì)胞癌腫瘤血管生成及其臨床病理意義

劉明閣，于慶凱

(河南省腫瘤醫(yī)院病理科 河南鄭州 450003)

實(shí)體瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成，肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是富血供的腫瘤，因此影響血管發(fā)生及生長的影響因子對HCC的診斷及治療具有重要意義［1］。近幾年來，細(xì)胞因子及腫瘤血管形成對腫瘤影響的研究越來越受到重視，本研究主要針對兩個(gè)因子、一個(gè)指標(biāo)與HCC的關(guān)系進(jìn)行探討。兩個(gè)因子:血管組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF);一個(gè)指標(biāo):微血管密度(microvessel density，MVD)。其中，根據(jù) CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)來測定MVD［2］。本研究旨在探討HIF-1α的表達(dá)、VEGF的表達(dá)、MVD之間的相互作用，及其對HCC的病理學(xué)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河南省腫瘤醫(yī)院肝膽外科2012年4月至2013年5月期間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)HCC的標(biāo)本66例，其中男性42例，女性24例;年齡36～69歲，平均53.3歲;腫瘤直徑≤5 cm 21例，＞5 cm 45例;腫瘤組織發(fā)生轉(zhuǎn)移39例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移27例;按照臨床分期:Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期25例。所有標(biāo)本均經(jīng)本院病理科進(jìn)行固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片、染色、封片等常規(guī)步驟。處理步驟、方法之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)本切片采用免疫組化染色技術(shù)，具體流程如下:①甲醛固定，4℃，20%蔗糖溶液過夜;②制作蠟塊:常規(guī)浸蠟、包埋、切片、貼片操作，PBS清洗(清洗5 min，重復(fù)3次);③使用0.3%的過氧化氫甲醇溶液處理30 min，PBS清洗同②;④加入配好的0.3%Triton X-100 溶液處理30 min，PBS清洗同②;⑤加入血清稀釋液稀釋的一抗，4℃處理24～48 h，吸去抗體，PBS清洗同②;⑥加入PBS處理的二抗，室溫處理2 h，PBS清洗同②;⑦加入抗體，室溫處理2 h，PBS清洗同②，蒸餾水迅速沖洗3次;⑧加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色操作，酒精梯度脫水后，透明、封片、拍照。

1.3 結(jié)果判定 HIF-1α經(jīng)免疫組化染色后，著色部位主要位于胞漿，陽性細(xì)胞鏡下顯示棕黃色顆粒。每計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)大于10記為陽性，無陽性細(xì)胞或細(xì)胞數(shù)小于10記為陰性。VEGF經(jīng)免疫組化染色后，胞質(zhì)和胞膜中均可出現(xiàn)棕黃色顆粒，鏡下陽細(xì)胞數(shù)≥30%者記為陽性，＜30%以及無著色者記為陰性。根據(jù)CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)來測定腫瘤微血管密度(MVD)。首先，在低倍鏡下進(jìn)行初步掃片，選擇3個(gè)血管豐富的區(qū)域作為分析區(qū)域。然后，在高倍鏡下(×200)計(jì)數(shù)被染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)簇?cái)?shù)目。最后，取3個(gè)區(qū)域的平均值作為該組織的MVD值［3］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有資料采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，定量資料采用t檢驗(yàn)，定性資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、VEGF的表達(dá)及 MVD值比較 HCC組織的HIF-1α、VEGF表達(dá)及MVD值均顯著增高，癌癥組織與癌旁非腫瘤組織的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、表2。

表1 肝細(xì)胞肝癌與癌旁非腫瘤組織HIF-1α、VEGF表達(dá)陽性率對比［n，(%)］

表2 肝細(xì)胞肝癌與癌旁非腫瘤組織MVD值對比(±s)

表2 肝細(xì)胞肝癌與癌旁非腫瘤組織MVD值對比(±s)

組別 n MVD值＜0.05 66 40.82±21.40癌旁非腫瘤組織 20 22.20±11.83 t 3.713 P肝細(xì)胞癌

2.2 不同病理特征下HIF-1α、VEGF的表達(dá)及MVD值的比較 HIF-1α、VEGF、MVD在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)與腫瘤大小、AFP值的高低、病理分級無關(guān)(P＞0.05)。轉(zhuǎn)移組HIF-1α、VEGF的表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)移組(P＜0.01);轉(zhuǎn)移組MVD值顯著高于未轉(zhuǎn)移組(P＜0.01)。見表3、表4。

表3 不同病理特征下HIF-1α、VEGF表達(dá)的比較

表4 不同病理特征下MVD值的比較研究(±s)

表4 不同病理特征下MVD值的比較研究(±s)

t P腫瘤直徑組別 n MVD值1.594 0.112≤5 cm 21 47.11±18.26＞5 cm 45 39.10±19.29 AFP 0.426 0.672≤400 μg/L 20 45.70±6.80＞400 μg/L 46 44.90±7.10腫瘤轉(zhuǎn)移6.517＜0.01

續(xù)表4

3 討論

肝細(xì)胞肝癌是全球發(fā)病率較高的疾病之一，由于其病情發(fā)展迅速、治療難度大、預(yù)后效果差，已成為臨床上主要的研究課題［4］。近年來，有學(xué)者提出，由于HCC具有豐富的血管供應(yīng)，其腫瘤血管生成可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［5］。因此，本研究對腫瘤血管及其相關(guān)因子對HCC的影響進(jìn)行探討。

研究認(rèn)為，MVD值最能夠充分反映HCC腫瘤血管的發(fā)生、發(fā)展過程，本研究以CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)來測定MVD值，對其表達(dá)及影響因素進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，MVD在腫瘤組織中具有高表達(dá)，且MVD值的高低與腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與腫瘤直徑、AFP值及病理分期無關(guān)。因此可以推斷MVD值可以反映HCC腫瘤血管的生成，并可以作為腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的評價(jià)指標(biāo)。有文獻(xiàn)表明MVD能夠直接反應(yīng)腫瘤血管的生成狀況，間接反映腫瘤的生長情況、發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的能力［6］，因此本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

由于HCC為富血供的實(shí)體瘤，缺氧情況明顯，并且腫瘤血管的生成需要各種因子的刺激，HIF-1α為重要的缺氧調(diào)節(jié)因子，VEGF為重要的誘導(dǎo)血管生成的調(diào)節(jié)因子［7］。因此，本研究對 HIF-1α、VEGF 兩個(gè)因子進(jìn)行探討，并嘗試分析兩者與MVD值之間的關(guān)系。本研究顯示:HCC組織的HIF-1α、VEGF的表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤組織，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織中HIF-1α、VEGF的表達(dá)顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織(P＜0.05)，且與腫瘤直徑、AFP值及病理分期無關(guān)(P＞0.05)。此結(jié)果說明HIF-1α、VEGF是HCC腫瘤血管生成重要的調(diào)節(jié)因子，在臨床工作中應(yīng)給予重視。

此次研究中將MWD值、HIF-1α、VEGF的表達(dá)放在一起進(jìn)行比較，結(jié)果顯示三者的表達(dá)呈正相關(guān)，因此可以推斷MVD受HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響與調(diào)控，均與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)。在臨床治療中可以通過減少或抑制HIF-1α、VEGF的表達(dá)來減緩腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程。

另外，本研究中，HIF-1α、VEGF在HCC組織中的表達(dá)率分別為83.33%、81.08%，且在發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中均具有高表達(dá)，因此可以推測，HIF-1α與VEGF的表達(dá)兩者之間可能有相關(guān)性，兩者相互促進(jìn)，共同調(diào)控腫瘤血管的生成，其臨床意義有待進(jìn)一步研究。

［1］Sato Y.Is vasohibin-1 for more than angiogenesis inhibition［J］.Journal of Biochemistry，2011，149(3):229-230.

［2］Lu C，Han H D，Mangala L S，et al.Regulation of tumorangiogenesis by EZH2［J］.Cancer cell，2010，18(2):185-197.

［3］Zhang L，Wang J N，Tang J M，et al.VEGF is essential for the growth and migration of human hepatocellular carcinoma cells［J］.Molecular biology reports，2012，39(5):5085-5093.

［4］Choedon T，Dolma D，Kumar V.Pro-apoptotic and anticancer properties of Thapring-A Tibetan herbal formulation［J］.J Ethnopharmacology，2011，137(1):320-326.

［5］Okamoto K，Neureiter D，Ocker M，et al.Biomarkers for novel targeted therapies of hepatocellular carcinoma［J］.Histol Histopathol，2009，24(4):493-502.

［6］Patel N S，Muneer A，Blick C，et al.Targeting vascular endothelial growth factor in renal cell carcinoma［J］.Tumour Biol，2009，30(5-6):292-299.

［7］Liu Y，Chen Z，Liu C，et al.Gadolinium-loaded polymeric nanoparticles modified with Anti-VEGF as multifunctional MRI contrast agents for the diagnosis of liver cancer［J］.Biomaterials，2011，32(22):5167-5176.