miR-145靶向調(diào)控DAB2對前列腺癌PC3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

謝樹高,謝銀銀,張元亮,黃秋花

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院,醫(yī)學(xué)基因組學(xué)國家重點實驗室,上海血液學(xué)研究所,上海 200025;2.諾思格(北京)醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司,北京 100048

MicroRNA是一類長約19～24 nt的非編碼單鏈小RNA 分子,可以通過與靶基因 3′非翻譯區(qū)域(3′UTR)互補結(jié)合抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì),或直接使靶向結(jié)合的mRNA發(fā)生降解,進(jìn)而在細(xì)胞、組織或個體水平上影響細(xì)胞生長、凋亡和分化及生物體的生長發(fā)育,并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)microRNA的表達(dá)具有明顯的組織特異性,在一些疾病中 microRNA表達(dá)譜的改變具有明顯的特征性,尤其是在腫瘤疾病中,其表達(dá)與正常組織具有顯著差異。

據(jù)文獻(xiàn)報道m(xù)iR-145在多種腫瘤中呈低表達(dá)[1,2],包括食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、宮頸癌、胰腺癌和白血病等,通過與多個靶基因KRAS、C-Myc和FSCN1等作用抑制細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3～7]。Chiyomaru等[8]運用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)成功鑒定到miR-145靶基因SWAP70(SWAP switching B-cell complex 70 kDa subunit),并證明miR-145可通過下調(diào)SWAP70抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

為了更加深入地研究miR-145在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用,本研究通過 Targetscan軟件對它的靶基因進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示在DAB2(Disabled homolog 2)基因的 3′UTR區(qū)域存在多個 miR-145的結(jié)合位點。DAB2基因被認(rèn)為是一個重要的腫瘤抑癌基因,在多種腫瘤標(biāo)本中常常發(fā)生缺失或者發(fā)生高度甲基化而表達(dá)沉默[9～12]。也有文獻(xiàn)報道 TGF-β能通過上調(diào)DAB2基因的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程[13],EMT是腫瘤細(xì)胞從原位向遠(yuǎn)處遷移和侵襲的重要細(xì)胞生物學(xué)機制[14,15],提示DAB2可能也具備促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。

PC3是一種具高侵襲能力的前列腺癌細(xì)胞株,常常用來研究一些抑癌基因?qū)δ[瘤基本生物學(xué)功能的影響,如細(xì)胞生長、遷移和侵襲等。miR-145在包括前列腺癌在內(nèi)的多種細(xì)胞中表達(dá)水平較低,本研究發(fā)現(xiàn)PC3細(xì)胞內(nèi)DAB2呈現(xiàn)較高表達(dá)狀態(tài),miR-145是否能通過靶向調(diào)控DAB2進(jìn)而影響PC3細(xì)胞的遷移和侵襲尚未可知。本文以 PC3細(xì)胞為模型,對 miR-145和DAB2的相互關(guān)系進(jìn)行研究,以揭示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1640培養(yǎng)基、FBS及Opti MEM購自GIBCO;PGEM-T easy試劑盒、pGL3-control和Prl-SV40質(zhì)粒、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自Promega; 感受態(tài)大腸桿菌 TOP10購自天根; 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、T4 DNA連接酶及SYBR premix ExTaq(TLi RNaseH Plus) 熒光定量試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司; ABI高容量逆轉(zhuǎn)試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒購自ABI; KOD plus購自TOYOBO; 質(zhì)粒提取試劑盒購自 MN(MACHEREY-NAGEL); 核酸純化試劑盒購自AXYGEN; microRNA轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin購自 Polyplus transfection; FuGENE轉(zhuǎn)染試劑購自Roche; TRIzol試劑購自 Invitrogen; 人工合成的miRNA：hsa-miR-145-mimics購自上海吉瑪制藥,序列如下：

正向 5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′;

反向 5′-GGAUUCCUGGGAAAACUGGACUU-3′。

1.2 方法

1.2.1 PC3細(xì)胞內(nèi)miR-145表達(dá)水平的檢測

細(xì)胞收集、裂解和逆轉(zhuǎn)錄過程均按照ABI高容量cDNA逆轉(zhuǎn)試劑盒要求進(jìn)行。取4 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄引物為miR-145反向引物,序列見表1)。按照SYBR Green PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒的要求,將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)預(yù)處理。PCR預(yù)反應(yīng)產(chǎn)物按照 1：400稀釋后取2 μL用于實時定量PCR(ABI)反應(yīng)( PCR反應(yīng)預(yù)處理及實時定量PCR引物均為miR-145正反向引物,序列見表1),以此檢測PC3細(xì)胞內(nèi) miR-145表達(dá)水平。

1.2.2 突變型熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建

經(jīng)TargetScan預(yù)測人DAB2基因3′UTR區(qū)域含有3個miR-145結(jié)合位點。PCR擴(kuò)增含有這3個位點的區(qū)域(擴(kuò)增引物為DAB2-3′UTR正反向引物,序列見表1),將擴(kuò)增得到的片段連接入PGEM-T easy載體,測序獲得陽性克隆后,EcoRⅠ單酶切構(gòu)建入PGL3載體,插入的DAB2基因 3′UTR區(qū)域片段長825 bp。以構(gòu)建的pGL3-DAB2-3′UTR質(zhì)粒為模板分別進(jìn)行定點缺失突變(突變引物分別為DAB2-3′UTR-del1084-1090、DAB2-3′UTR-del1604-1610 及DAB2-3′UTR-del1737-1743正反向引物,序列見表1),突變完成后取5 μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖電泳檢測,取10μL產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并進(jìn)行質(zhì)粒抽提及測序鑒定。

1.2.3 熒光素酶報告基因檢測miR-145對DAB23′-UTR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

293T細(xì)胞鋪48孔板,培養(yǎng)24 h之后在FuGENE轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下,將pGL3-DAB2-3′UTR及各缺失突變型質(zhì)粒與 hsa-miR-145-mimics和 SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后24 h棄培養(yǎng)液,1×PBS洗3次,每孔加入100 μL的PLB裂解液,充分裂解細(xì)胞,取20 μL細(xì)胞裂解液加入100 μL LARII,測熒光強度 1(A),加入 100 μL Stop & Glo試劑,測熒光強度2(B)。實驗得到的數(shù)據(jù)按照A：B計算比值。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和miR-145轉(zhuǎn)染

用含10%FBS的RPMI MEDIUM 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)PC3細(xì)胞。細(xì)胞在3.5 cm培養(yǎng)皿中生長至60%匯合時,同步進(jìn)行 hsa-miR-145-mimics和 miRNA 陰性對照(Negative control,NC)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行,使microRNA的終濃度為100 nmol/L和200 nmol/L; 轉(zhuǎn)染完12 h更換新鮮培養(yǎng)基,然后間隔24 h換培養(yǎng)基直至轉(zhuǎn)染完72 h收取細(xì)胞。

1.2.5DAB2基因 mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測(Western blot)

收取轉(zhuǎn)染 hsa-miR-145-mimics和 NC 72 h的PC3細(xì)胞,用 TRIzol試劑裂解并抽提總 RNA,經(jīng)NanoDrop紫外定量儀定量,分別取1 μg 總RNA用TaKaRa PrimeScript RT Reagent kit with gDNA Eraser 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物20倍稀釋之后取2 μL用于20 μL體系實時定量PCR(ABI 7500定量PCR儀),采用TaKaRa公司的SYBR premix ExTaq(TLi RNaseH Plus)試劑盒,以HPRT為內(nèi)參(實時定量PCR引物為DAB2和HPRT正反向引物,序列見表1)。

將上一步實驗獲得細(xì)胞用 RIPA裂解液加羅氏蛋白酶抑制劑 cocktail裂解,離心后取上清并用Bradford試劑定量。hsa-miR-145-mimics組及NC 200 nmol/L組樣本上樣量均為30 μg。10%SDS PAGE膠在110 V恒壓電泳2.5 h,轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色檢查轉(zhuǎn)膜效果,用封閉液(TBST含5%脫脂奶粉)封閉1 h。一抗孵育時DAB2使用比例為 1：500,內(nèi)參：β-actin使用比例為 1：10 000,4℃過夜。然后TBST洗膜3次,每次10 min。

1.2.6 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測

按前述轉(zhuǎn)染方法將 hsa-miR-145-mimics及 NC分別瞬時轉(zhuǎn)入PC3細(xì)胞(終濃度為200 nmol/L),轉(zhuǎn)染24 h后將細(xì)胞按每孔5×105接種到6孔板上。細(xì)胞貼壁24 h后細(xì)胞基本匯合,迅速在細(xì)胞上劃出寬度均一的劃痕,洗去懸浮的細(xì)胞之后將培液換成低血清濃度(1%)培養(yǎng)基。然后選取0 h、6 h、12 h、24 h及36 h等時間點拍照記錄同一位置細(xì)胞遷移情況。

表1 本文所用引物信息

細(xì)胞侵襲實驗過程如下：將前述 hsa-miR145-mimics及NC瞬時轉(zhuǎn)入的PC3細(xì)胞于轉(zhuǎn)染48 h后用BD公司BD BioCoat? -Matrigel Invasion Chambers試劑盒進(jìn)行細(xì)胞侵襲實驗,每孔初始細(xì)胞量為5×104,侵襲后用0.1%結(jié)晶紫染色,全片計數(shù)。具體流程參考BD說明書。

1.2.7Dab2過表達(dá)及修復(fù)實驗

將小鼠Dab2基因全長cDNA克隆入真核表達(dá)載體 MigR1的NotⅠ單酶切位點。將 7×105PC3細(xì)胞接種到6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中,細(xì)胞密度達(dá)到50%～70%左右用Lipo2000轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)入MigR1-Dab2及MigR1空載質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染前2 h換液。轉(zhuǎn)染體系如下：Opti-MEM 300 μL,質(zhì)粒 8 μg,Lipo2000 20 μL; 混勻靜置 20 min; 將混合物逐滴加入到細(xì)胞中,輕輕晃勻,置于 37℃培養(yǎng); 24 h后將細(xì)胞按合適比例傳代,傳代24 h后轉(zhuǎn)染hsa-miR145-mimics及NC。24 h后分 PC3、PC3+Dab2、PC3+hsa-miR145-mimics、PC3+Dab2+hsa-miR145-mimics 等 4組分別進(jìn)行遷移和侵襲能力檢測。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

對熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測、實時定量PCR檢測及侵襲能力檢測得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用 Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,對所有待比較數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗分析,P<0.05為顯著差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-145抑制前列腺癌細(xì)胞PC3的遷移和侵襲

鑒于已有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-145具有抑制腫瘤細(xì)胞功能的作用,本研究選擇了具高侵襲能力但 miR-145低表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞 PC3,觀察 miR-145對PC3細(xì)胞株主要生物學(xué)功能的影響。在PC3細(xì)胞株中瞬時過表達(dá)hsa-miR145-mimics化學(xué)小分子,進(jìn)行體外劃痕實驗。NC組在劃痕6 h已能觀察到一些細(xì)胞的遷移,36 h基本鋪滿整個劃痕區(qū)域; 然而 hsamiR145-mimics處理的細(xì)胞直到24 h才能觀察到少量細(xì)胞的遷移,兩組間存在顯著差異(圖1A),提示miR-145可以有效抑制PC3細(xì)胞的遷移能力。

圖1 miR-145過表達(dá)后PC3細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測結(jié)果

同時采用 Transwell chamber試劑盒檢測 miR-145對PC3細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示,NC轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞計數(shù)為1312±40,miR-145轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞計數(shù)為332±37,PC3細(xì)胞過表達(dá)miR-145之后其穿過半透膜的能力顯著低于NC組(P<0.0001)(圖1B),提示 miR-145可以有效抑制 PC3細(xì)胞的侵襲能力。

2.2 miR-145在體外可以靶向調(diào)節(jié)DAB2基因

為了進(jìn)一步探尋miR-145抑制PC3細(xì)胞遷移和侵襲的機制,本研究應(yīng)用 Targetscan軟件來預(yù)測其潛在靶基因,發(fā)現(xiàn)DAB2基因的 3′UTR區(qū)域存在 3個 miR-145的結(jié)合位點,分別位于DAB23′UTR 1084-1090、1604-1610及 1737-1743(圖2A)。為了證實DAB2確為miR-145的靶基因,825 bp的DAB2基因3′UTR區(qū)域被構(gòu)建到pGL3熒光素酶報告基因的載體中,miR-145的3個結(jié)合位點分別作單獨及聯(lián)合缺失突變,分析miR-145對這些突變體的調(diào)控作用。體外熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,miR-145可以顯著抑制野生型DAB2組的熒光素酶活性,突變?nèi)魏我粋€結(jié)合位點都可以恢復(fù)熒光素酶的活性(圖2B),提示miR-145在體外可以靶向調(diào)節(jié)DAB2基因。

2.3 DAB2在高侵襲前列腺癌細(xì)胞PC3中相對高表達(dá)

DAB2基因被賦予“抑癌基因”的稱號,為了明確其在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平,本研究選取了代表前列腺癌不同進(jìn)展階段的 LnCAP、Du145及PC3細(xì)胞株,并通過實時定量 PCR的方法檢測DAB2基因在這3個細(xì)胞株中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,DAB2在高侵襲PC3細(xì)胞株中表達(dá)水平最高(圖3A)。

2.4 miR-145可以抑制PC3細(xì)胞內(nèi)DAB2的表達(dá)水平

圖2 熒光素報告基因檢測miR-145對DAB2-3′UTR的調(diào)節(jié)作用

圖3 外源表達(dá)miR-145前后PC3細(xì)胞內(nèi)DAB2表達(dá)水平的檢測

體外實驗已經(jīng)證實miR-145可以靶向抑制DAB2,那么PC3細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的DAB2能否被miR-145靶向抑制？鑒于 miRNA主要通過降解靶基因 mRNA或者抑制靶基因蛋白翻譯,從而達(dá)到影響靶基因的表達(dá)水平。因此,本研究在 PC3細(xì)胞內(nèi)外源表達(dá)miR-145后,分別采用實時定量RT-PCR以及Western blot的方法,檢測DAB2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示,miR-145轉(zhuǎn)染組的DAB2的mRNA表達(dá)水平呈降低趨勢,但下調(diào)幅度未達(dá) 2倍(圖 3B),而DAB2蛋白條帶明顯弱于對照組(圖3C)。上述結(jié)果提示在PC3細(xì)胞內(nèi)miR-145可能主要在蛋白翻譯層面抑制DAB2的表達(dá)。

2.5 外源表達(dá)Dab2可以部分解除miR-145對PC3細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制

miR-145對PC3細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制是否通過靶向調(diào)控DAB2基因發(fā)揮作用？為了回答這個問題,本研究在miR-145處理的PC3細(xì)胞株中過表達(dá)不包含3′UTR的小鼠Dab2全長質(zhì)粒,并檢測其遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示,與單轉(zhuǎn) miR-145組相比,miR-145和Dab2共表達(dá)組細(xì)胞遷移能力有顯著恢復(fù)(圖 4A); 侵襲能力檢測實驗中穿膜細(xì)胞計數(shù)PC3空白對照組為1320±17,PC3過表達(dá)Dab2組為1377±7,PC3過表達(dá) miR-145組為 429±11,PC3過表達(dá) miR-145+Dab2組為 946±11,與單轉(zhuǎn) miR-145組相比,miR-145和Dab2共表達(dá)組細(xì)胞遷移能力有顯著回復(fù)(P<0.0001)(圖 4B)。上述實驗數(shù)據(jù)表明,miR-145對PC3細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制至少部分是通過靶向抑制DAB2這條途徑發(fā)揮作用。

3 討 論

miR-145已被證實在多種腫瘤中呈低表達(dá),并可通過與多個靶基因的作用抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能,本文通過靶點預(yù)測和體外熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)miR-145能靶向抑制DAB2。同時實驗結(jié)果顯示3個miR-145預(yù)測結(jié)合位點對于DAB2的抑制效果相近,任一位點缺失突變之后這種抑制作用均被不同程度解除,3個位點聯(lián)合缺失突變則能完全解除抑制。

PC3細(xì)胞中外源表達(dá)miR-145后PC3細(xì)胞的遷移和侵襲能力有顯著降低,但是將DAB2與miR-145共同轉(zhuǎn)進(jìn)PC3細(xì)胞之后,DAB2在一定程度上能夠糾正 miR-145對腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。這些數(shù)據(jù)證實DAB2是miR-145的下游靶基因之一,并可能在前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲過程中扮演了一個重要角色。與此類似的是,當(dāng)我們在PC3細(xì)胞中通過shRNA特異性降低DAB2基因的表達(dá)水平,可以明顯抑制 PC3細(xì)胞遷移和侵襲能力,同樣 在DAB2低表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞株LnCAP中過表達(dá)小鼠Dab2基因,可以明顯增強LnCAP細(xì)胞的侵襲能力(另文發(fā)表)。進(jìn)一步提示 DAB2在前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲過程中扮演著重要作用。

圖4 外源表達(dá)Dab2后檢測miR-145對PC3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

DAB2一直以來被認(rèn)為是一個重要的腫瘤抑癌基因,在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低下,然而本研究結(jié)果顯示在高侵襲能力的前列腺癌細(xì)胞株 PC3中DAB2表達(dá)較高,且受到另一腫瘤抑制因子miR-145的抑制,這個現(xiàn)象引起我們高度關(guān)注。另外,近年來在其他腫瘤細(xì)胞中也有DAB2的報道,如Yang等[16]在惡性外周神經(jīng)鞘瘤中也發(fā)現(xiàn)DAB2基因表達(dá)異常增高。Chao等[17]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌患者中DAB2能影響癌細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展。這就提示我們,DAB2可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展不同階段通過不同的作用機制從而發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。

已有研究證實DAB2是上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵因子,現(xiàn)有的大量研究證據(jù)表明,EMT 在腫瘤的惡性演進(jìn)過程中也發(fā)揮了舉足輕重的作用,多數(shù)腫瘤在原位時已經(jīng)發(fā)生了EMT過程,上皮細(xì)胞的多形性改變和去分化是腫瘤侵潤和演進(jìn)過程中的重要標(biāo)志。在乳腺癌和結(jié)腸癌中的研究結(jié)果表明,腫瘤細(xì)胞外形的改變及其粘附性的下降或消失在腫瘤的原位侵潤和異位轉(zhuǎn)移以及新的轉(zhuǎn)移灶的形成過程中起到重要的作用[18]。在前列腺癌的研究中,Untergasser等[19]發(fā)現(xiàn),用 TGF-β1、β2及 β3干預(yù)人前列腺細(xì)胞24 h后,上皮細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物：波形纖維蛋白,提示EMT過程的發(fā)生。DAB2是否參與了前列腺癌的EMT發(fā)生過程? miR-145是否通過調(diào)控DAB2參與了前列腺癌的EMT發(fā)生過程？這些問題都有待更深入地研究。

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