南極磷蝦油的氣相色譜指紋圖譜和聚類分析

劉建君，汪勝福，門敬菊，郭忠，馮迪娜，王嘉麒，呂晶

（1.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司技術(shù)中心，遼寧大連116113；2.中國人民解放軍第210醫(yī)院臨床藥理基地，遼寧大連116011）

南極磷蝦（Antarctic krill）學(xué)名 Euphausia superba，屬于動(dòng)物界節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼亞門軟甲綱、磷蝦目、磷蝦科。其富含蛋白質(zhì)、磷脂、蝦青素、甲殼素、酶等營養(yǎng)成分與活性成分；提取出來的南極磷蝦脂類所含的脂肪酸種類多，且多為不飽和脂肪酸，尤其EPA和DHA含量較高[1]。故而，南極磷蝦近年來引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注。隨著消費(fèi)者需求量的不斷增加，市場上出現(xiàn)的南極磷蝦油品種繁多，魚龍混珠現(xiàn)象時(shí)常出現(xiàn)，品質(zhì)存在較大差異，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者利益，因此，建立南極磷蝦油產(chǎn)品品質(zhì)的真?zhèn)蝺?yōu)劣的分析方法，對于當(dāng)前南極磷蝦產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有極其重要的意義。中藥指紋圖譜（TCMF）作為中藥及其制劑質(zhì)量控制的有效手段，已受到了中藥界的廣泛關(guān)注，同時(shí)也是被國內(nèi)外廣泛接受的一種有效的中藥材品種鑒定、產(chǎn)地溯源和質(zhì)量控制手段，而色譜和光譜技術(shù)是研究中藥指紋圖譜的兩種主要方法，例如：高效液相色譜、氣相色譜和毛細(xì)管電泳等方法已經(jīng)用于TCMF的研究；色譜TCMF因其具有宏觀、綜合、模糊和非線性等特性[2]，須借助計(jì)算機(jī)對其進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，聚類分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等數(shù)據(jù)的解析方法已用于該研究。

在南極磷蝦油甲酯化前處理的基礎(chǔ)上，對10批南極磷蝦油樣品進(jìn)行指紋圖譜和聚類分析的模式識(shí)別研究，建立南極磷蝦油氣相指紋圖譜分析方法，為來自南極洲不同海域、生產(chǎn)國及廠家的南極磷蝦油鑒別與質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試樣及試劑

南極磷蝦油：遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司；EPA/DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：美國SIGMA公司。異辛烷、正己烷、甲醇均為色譜純；氫氧化鉀、濃硫酸為分析純；2 mol/L KOH-甲醇溶液、2 mol/L硫酸-甲醇溶液：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

7820A型氣相色譜儀（附氫火焰離子化檢測器）：美國 Agilent公司；AL204型電子天平（0.1 mg）：（梅特勒-托利（Metter Toledo）公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：長沙湘智離心機(jī)儀器公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：HP-88型石英毛細(xì)管柱，100 m×0.250 mm×0.20 μm；摸索出最佳色譜程升條件：120 ℃，5 min，5℃/min到 175℃，10 min，5℃/min到210℃，5 min；5℃/min到230℃，10 min；總時(shí)長52 min；進(jìn)樣口溫度：250℃；FID檢測器溫度：270℃；進(jìn)樣方式：分流，分流比 10∶1；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：高純氮?dú)猓?9.999%）。

在以上色譜條件下，33種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成分實(shí)現(xiàn)基線分離，保留時(shí)間精密度RSD＜1.0%，各組分峰面積精密度RSD＜1.5%；其余4種組分分離度小于1.5，即：γ-亞麻酸與花生酸保留時(shí)間在32.600 min（RSD為0.78%）；二十二碳酸與二十碳三烯酸保留時(shí)間在37.331 min（RSD為0.67%），氣相色譜圖詳見圖1。

圖1 37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品在HP-88型毛細(xì)管柱上的氣相色譜圖Fig.1 37 kinds of mixed fatty acid methyl esters standards in GC using HP-88 capillary column

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，檢測指紋圖譜。結(jié)果表明，其相對保留時(shí)間RSD＜1.0%，主要共有峰相對峰面積比值的RSD＜1.0%，符合指紋圖譜要求。

1.4.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批樣品5份，制備供試品溶液，檢測指紋圖譜。結(jié)果表明，其相對保留時(shí)間RSD＜1.0%，主要共有峰相對峰面積比值的RSD＜2.0%，符合指紋圖譜要求。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別在 0、2、6、18、12 h 檢測指紋圖譜。結(jié)果表明，其相對保留時(shí)間RSD＜1.0%，主要共有峰峰面積的RSD＜2.0%，符合指紋圖譜要求。

1.4.4 共有特征峰的篩選

以L20130729E01批南極磷蝦油為參照對象，進(jìn)行特征峰篩選，篩選結(jié)果如下：確定出13個(gè)共有特征峰，分別是：肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、組分D、硬脂酸、油酸、組分E、亞油酸、α-亞麻酸、二十一碳酸、EPA、DHA。見圖2和表1。

圖2 L20130729E01批南極磷蝦油的氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of L20130729E01 batch antarctic krill oil sample

表1 南極磷蝦油13個(gè)特征峰的信息Table 1 Antarctic krill oil 13 mark peaks information

通過在HP-88毛細(xì)管柱及以上優(yōu)化色譜條件，達(dá)到較好的組分峰分離效果，從而，選出13個(gè)共有特征組分峰，進(jìn)行以下數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，10批南極磷蝦油甲酯化樣品歸一化法各組分的百分面積信息，見表2。

2 色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)及聚類分析

2.1 中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（A版）評(píng)價(jià)南極磷蝦油的相似度

將10批南極磷蝦油的氣相色譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（國家藥典委員會(huì)2004A版）》，通過多點(diǎn)校正法對色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成南極磷蝦油的色譜指紋圖譜共有模式，見圖3。

在分析檢驗(yàn)?zāi)Ｊ较拢訪20130729E01批南極磷蝦油樣品圖譜作為參照圖譜，進(jìn)行相似度計(jì)算與評(píng)價(jià)，結(jié)果見表3。

相似度結(jié)果情況：批號(hào)N20130724E01樣品相似度為0.906，相似度最低，其次是N20130724E02樣品為0.953，其余8批樣品相似度均大于0.955；圖譜的相似度評(píng)價(jià)作為一種系統(tǒng)性、綜合性的判定指標(biāo)，為南極磷蝦油的品質(zhì)控制提供了一個(gè)有效的參考方法。

表2 10批南極磷蝦油樣品面積歸一化法各組分的數(shù)據(jù)Table 2 The peak area normalization method of each component data about 10 batches of antarctic krill oil

表3 10批南極磷蝦油的GC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Table 3 The GC Fingerprint Similarity Evaluation of 10 batches of antarctic krill oil

圖3 10批南極磷蝦油的GC指紋圖譜Fig.3 The GC fingerprints of 10 batches of antarctic krill oil

2.2 基于脂肪酸成分的系統(tǒng)聚類分析鑒別

本實(shí)驗(yàn)采用SSPS19.0聚類分析軟件包，包括系統(tǒng)聚類、模糊聚類、圖論聚類等多種聚類分析方法；本文選擇系統(tǒng)聚類的最近鄰元素、組間距離法（Betweengroups linkage）和歐氏距離平方（Squared euclindean distance）處理各批次樣品的色譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行聚類分析，其分析結(jié)果見表4和圖4。

表4 10批南極磷蝦油樣品系統(tǒng)聚類分析數(shù)據(jù)Table 4 The clustering analysis data about the 10 batches of antarctic krill oil

圖4 10批南極磷蝦油樣品系統(tǒng)聚類分析圖Fig.4 The figure of genealogied cluster analysis about the 10 batches of antarctic krill oil

通過最近鄰元素、組間距離法的聚類分析可以看出，10批樣品的結(jié)果如下：組間距離法的結(jié)果：當(dāng)歐氏距離d大于13時(shí)，可分為三類，即：1、4與5為一類（d≤2）；7、8、9、10 為一類（5＜d＜10），2、3、6 聚為一類（13＜d≤15）。因此，L20130729E01、X-20130528E01、X-20130707E01這3批聚為一類（d≤2），而且d值最小，這說明所用南極磷蝦原料為2011年與2012年的鮮品凍蝦，貯存時(shí)間較長，且接近；X-20130812E01、F20130807E01、F20130808E01、F20130812E01 四批聚為一類（5＜d＜10），其中三者甚為一致，說明這 3 批南極磷蝦油均為2013年的鮮品凍蝦原料提取，另外X-20130812E01這批明顯有一定區(qū)別，是南極磷蝦干粉醇提得到的磷蝦油；N20130724E02、N20130724E01、X-20130807E01這3批聚為一類（13＜d≤15）；說明N20130724E02、N20130724E01批次南極磷蝦油提取工藝與其他8批次提取工藝有所不同；但通過X-20130807E01這批精提工藝的樣品可以看出，N20130724E02和N20130724E01兩批磷蝦油很接近。

4 結(jié)論

綜上看來，基于HP-88型石英毛細(xì)管柱的氣相色譜信息，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（A版）》與IBM的SPSS19.0權(quán)威統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件共同對南極磷蝦油的13個(gè)共有特征組分峰進(jìn)行分析，可以看出：通過比較對照品的方法，已確定的南極磷蝦油指紋圖譜中13個(gè)共有的指紋峰中6個(gè)不飽和脂肪酸成分在南極磷蝦油指紋圖譜中的峰面積占總指紋峰峰面積的43%以上，其中n-3多不飽和脂肪酸（EPA、DHA）達(dá)20%以上，均具有很強(qiáng)的代表性和特征性。

南極磷蝦油經(jīng)過指紋圖譜法的測定后，從相似度的計(jì)算和聚類分析結(jié)果可以看出，不同工藝和原料貯存時(shí)間長短，對南極磷蝦油品質(zhì)上有一定的差別。隨著今后的研究，樣品量逐步增多，在HP-88型石英毛細(xì)管柱的色譜信息量加大，可以建立南極磷蝦油氣相色譜指紋圖譜鑒定信息系統(tǒng)。

指紋圖譜是現(xiàn)代分析中常用的手段之一，它能夠較充分得到某提取物質(zhì)獨(dú)特的信息[3]。系統(tǒng)聚類分析作為化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的一種，能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，對提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行充分的多元分析。二者結(jié)合起來使用為南極磷蝦油來源的識(shí)別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的思路和模式；將指紋圖譜法與相似度和聚類分析相結(jié)合來綜合評(píng)價(jià)南極磷蝦油質(zhì)量，其判斷結(jié)果更科學(xué)、更全面、更符合實(shí)際情況；從而為南極磷蝦的規(guī)范化捕撈、南極磷蝦來源的認(rèn)證和生產(chǎn)過程控制及南極磷蝦油產(chǎn)品真?zhèn)蝺?yōu)劣的甄別提供技術(shù)參考。