香椿組織培養(yǎng)技術(shù)研究

王曉蕾，方國臻

（天津科技大學(xué)，天津300457）

香椿（Toona sinensisRoem）是楝科香椿屬喬木，樹干通直，生長迅速，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和食療價(jià)值。

隨著生活水平的提高，人們逐漸加深對健康飲食的認(rèn)識，香椿的營養(yǎng)價(jià)值也越來越被人們認(rèn)可，在香椿組織培養(yǎng)中容易出現(xiàn)褐化、葉片污染、莖段污染等現(xiàn)象[1-4]。

通過研究香椿組織培養(yǎng)技術(shù)，可以擴(kuò)大香椿幼苗的生產(chǎn)量，縮短香椿幼苗的生長周期，進(jìn)而縮短香椿樹生長嫩葉的時(shí)間，從而降低香椿嫩葉的市場價(jià)，讓普通大眾更容易接受。達(dá)到利用食品生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)香椿的商業(yè)價(jià)值的目的。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料

香椿、香椿種子：由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑

乙醇（分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；升汞（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；B5培養(yǎng)基（生化試劑）：上海宇涵生物技術(shù)有限公司；蔗糖；瓊脂；碳酸鈉。

1.3 儀器、型號及生產(chǎn)廠家

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海山連實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子天平、電磁爐、電子計(jì)價(jià)秤、電子天平。

2 方法

2.1 香椿組織培養(yǎng)

2.1.1 香椿組織培養(yǎng)方案1

2.1.1.1 制作B5培養(yǎng)基

取B5培養(yǎng)基3.25 g、30 g/L蔗糖、0.8%瓊脂，將混合物放于燒杯中，加入1L蒸餾水，在電磁爐上煮沸。將混合均勻的培養(yǎng)基倒入三角瓶中。然后將培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶，紗布置于立式壓力蒸汽消毒器中滅菌30 min。滅菌結(jié)束后，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶中，即制成B5培養(yǎng)基。

2.1.1.2 培養(yǎng)香椿幼苗

將香椿種子去殼，除去雜物，用水清洗2次。然后將種子置于燒杯中浸泡，放到25℃恒溫箱中（12 h）。除去漂浮的種子，清洗下層的種子，將其置于盤子中，用濕紗布蓋上，放到25℃恒溫箱中（12 h）。取少許種子，放于培養(yǎng)皿中，用75%酒精溶液消毒20 s，再用0.1%升汞溶液消毒5 min，無菌水沖洗4次～6次。在超凈臺中將種子接種于B5培養(yǎng)基中，香椿種子的小頭朝下接種，培養(yǎng)無菌香椿幼苗。

2.1.1.3 香椿組織培養(yǎng)

在超凈臺上，挑取生長良好的無菌苗，切取其葉片，再次接種到B5培養(yǎng)基（含6-芐基嘌呤和萘乙酸）中。

2.1.1.4 觀察組培苗的生長狀況

每天觀察組培苗的生長狀況。

2.1.2 香椿組織培養(yǎng)方案2

2.1.2.1 制作B5培養(yǎng)基

取B5培養(yǎng)基3.25 g、30 g/L蔗糖、0.8%瓊脂，將混合物放于燒杯中，加入1L蒸餾水，在電磁爐上煮沸。將混合均勻的培養(yǎng)基倒入三角瓶中。然后將培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶，紗布置于立式壓力蒸汽消毒器中滅菌30 min。滅菌結(jié)束后，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶中，即制成B5培養(yǎng)基。

2.1.2.2 培養(yǎng)香椿幼苗

將香椿種子去殼，除去雜物，用水清洗2次。然后將種子置于燒杯中浸泡，放到25℃恒溫箱中（12 h）。除去漂浮的種子，清洗下層的種子，將其置于盤子中，用濕紗布蓋上，放到25℃恒溫箱中，香椿種子及紗布每天早晚清洗一次，注意觀察種子的發(fā)芽狀況，發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽即可將其種在沙土中，每天澆水，保持沙土表面濕潤，培養(yǎng)香椿幼苗。

2.1.2.3 香椿組織培養(yǎng)

在超凈臺上，挑取生長良好的香椿幼苗，切取其葉片用75%酒精溶液消毒20 s，再用0.1%升汞溶液消毒5 min，無菌水沖洗4次～6次。在超凈臺中將種子接種于B5培養(yǎng)基（含6-芐基嘌呤和萘乙酸）中。

2.1.2.4 觀察組培苗的生長狀況

每天觀察組培苗的生長狀況。

2.2 計(jì)算方法

30 d后，統(tǒng)計(jì)方案1、方案2香椿組培苗的生愈率、生芽率、死亡率、增殖倍數(shù)。

生愈率（%）=（生愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

生芽率（%）=（生芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

死亡率（%）=（整個(gè)莖段褐變但沒有被污染的莖段數(shù)目/總的莖段接種數(shù)）×100

增殖倍數(shù)（%）=（每次繼代培養(yǎng)中增殖后的芽數(shù)/接種芽數(shù)）×100

2.3 不同濃度6-芐基嘌呤和萘乙酸對香椿組培的影響

培養(yǎng)基中激素的用量，見表1。

表1 培養(yǎng)基中激素的用量Table 1 The medium hormone with scale mg/L

3 結(jié)果與結(jié)論

3.1 兩種組培方案對照

兩種組培方案對照情況表見表2。

表2 兩種組培方案的對照Table 2 Two kinds of transformation scheme

由表2可知：香椿組織培養(yǎng)的兩種方案均能在30d～40d培育出組培小苗。但是方案1的組培小苗較方案2的成活率高、增值倍數(shù)也高。原因可能有以下幾點(diǎn)：

1）方案1的種子提前進(jìn)行了消毒，培養(yǎng)的小苗即為無菌苗，避免了接種前對香椿幼苗組織的滅菌操作。而方案2在種子長成小苗之后再進(jìn)行滅菌操作，部分香椿組織被殺死，導(dǎo)致最終組培小苗成活率降低。

2）方案2的滅菌操作比較嚴(yán)格，滅菌時(shí)間短則污染率比較高，滅菌時(shí)間過長則死亡率比較高。

3.2 激素對香椿組織培養(yǎng)的影響

激素對香椿組織培養(yǎng)的影響見表3。

表3 激素對香椿組織培養(yǎng)的影響Table 3 The influence of hormone to cedar tissue culture

由表3可以看出，當(dāng)采用組號8的激素用量時(shí)，香椿組培苗的生芽率最高，而此時(shí)的生愈率也比較高。

4 結(jié)論

滅菌時(shí)間，培養(yǎng)基中激素的用量都會對香椿的組培造成影響。通過實(shí)驗(yàn)研究得知，采用方案1，組號8的激素用量，進(jìn)行香椿組織培養(yǎng)，香椿組培苗的成活率比較高。