熒光原位雜交技術(shù)在上尿路的尿路上皮癌診斷中的臨床意義

陳松 徐阿祥 孫圣坤 楊淑霞 張旭

1中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科100853北京

2清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院泌尿外科

上尿路的尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma，UTUC）如腎盂癌、輸尿管癌等是比較少見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。雖然UTUC只占全部尿路上皮癌的5%～10%，因其惡性程度高、病程進展快，確診時大多已浸潤周圍組織[1]，因此該類病變的早期診斷始終是臨床醫(yī)師及研究人員關(guān)注的重要問題。

目前，UTUC的診斷方法主要為尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查及輸尿管鏡檢。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性較低；而輸尿管鏡檢為有創(chuàng)檢查，相當(dāng)部分的患者因各種原因不能承受。近年來，熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）已愈來愈多地應(yīng)用于膀胱癌的檢測，其敏感性高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查。作為一項無創(chuàng)檢查，F(xiàn)ISH在膀胱癌診斷中的重要作用已有大量報道。本研究回顧性分析了中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科2009～2011年應(yīng)用FISH所進行的UTUC檢測資料，并對其臨床意義作進一步闡述。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2009～2011年我們對144例疑似上尿路的尿路上皮癌患者進行了FISH檢測，病理檢查證實陽性病例101例，男59例，女42例，年齡39～84歲，平均62.9歲。其中腎盂癌49例，輸尿管癌47例，腎盂合并輸尿管癌5例。該檢測在輸尿管鏡檢及腎輸尿管全長切除手術(shù)等有創(chuàng)操作之前進行。全部受檢者均行相關(guān)的膀胱影像學(xué)檢查及膀胱鏡檢，以排除同時合并膀胱腫瘤的可能性。檢測所用標(biāo)本為患者新鮮尿液300ml?；颊吡碛?0例為腎細(xì)胞癌。

1.2 FISH檢測主要試劑及方法

FISH實驗所應(yīng)用的探針由北京金薩嘉公司提供。7、17號染色體著絲粒探針為綠色熒光信號，3號染色體著絲粒探針和雜交到9號染色體長臂（9p21）的P16探針為桔紅色熒光信號。所有受試者均于內(nèi)鏡檢查前或手術(shù)前收集新鮮尿液300 ml送檢，按照試劑盒說明書方法進行FISH實驗操作。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

正常細(xì)胞的3、7、17號染色體著絲粒探針及P16探針均為二倍體，在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核分別可見2個綠色及2個紅色信號。出現(xiàn)非二倍體改變即為異常，為FISH檢測陽性結(jié)果。攝取熒光顯微鏡下的圖像，每組探針分析100～200個細(xì)胞。判斷標(biāo)準(zhǔn)：判定單體的標(biāo)準(zhǔn)為單個信號的核比例大于15%，3倍體及多倍體的標(biāo)準(zhǔn)為3個及多個信號的核大于10%細(xì)胞總數(shù)。組合探針陽性參照UroVysion推薦標(biāo)準(zhǔn)：至少在4個細(xì)胞中同時存在3、7、17號的2個染色體的擴增，或至少在12個細(xì)胞中存在9p21的純合性缺失。

1.4 組織學(xué)檢查及結(jié)果分析

對輸尿管鏡活檢組織或手術(shù)切除標(biāo)本進行常規(guī)HE制片，以組織學(xué)病理檢查結(jié)果作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，若同一病例出現(xiàn)組織活檢病理結(jié)果與手術(shù)切除標(biāo)本病理結(jié)果不一致時，以手術(shù)切除標(biāo)本病理結(jié)果為準(zhǔn)。將FISH檢測結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果對照，計算FISH的敏感性與特異性。敏感性＝真陽性／（真陽性＋假陰性），特異性＝真陰性／（真陰性＋假陽性）。其中真陽性指同一病例的病理學(xué)結(jié)果與FISH檢測結(jié)果均為陽性；假陽性為FISH檢測結(jié)果陽性而病理結(jié)果陰性；真陰性為FISH與病理結(jié)果均為陰性；假陰性為FISH陰性而病理結(jié)果為陽性。

2 結(jié)果

熒光顯微鏡下，非腫瘤性脫落細(xì)胞的FISH結(jié)果顯示各探針表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)2個紅色及2個綠色信號（圖1）。尿路上皮癌的尿脫落細(xì)胞FISH檢測結(jié)果顯示細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)多于或少于2個信號的改變，即FISH陽性結(jié)果（圖2）。在144例疑似患者中，病理診斷尿路上皮癌101例（腎盂癌49例、輸尿管癌47例、腎盂合并輸尿管癌5例）、尿路上皮良性病變33例。101例尿路上皮癌中，F(xiàn)ISH陽性55例、陰性46例；FISH敏感性為54.5%，33例良性病例中，陰性31例、FISH陽性3例；特異性為93.9%。在全部確診的UTUC病例中，高級別腫瘤56例、低級別21例；浸潤性腫瘤60例。高級別中33例FISH陽性，敏感性為58.9%；低級別腫瘤中FISH陽性6例，敏感性28.6%；另有10例病理診斷為腎細(xì)胞癌，其中透明細(xì)胞癌8例，乳頭狀腎細(xì)胞癌2例；該組病例中，F(xiàn)ISH陽性4例、陰性6例（表1）。

圖1 非腫瘤性脫落細(xì)胞的FISH結(jié)果

圖2 FISH陽性結(jié)果

表1 46例疑似上尿路的尿路上皮癌患者的病理及FISH檢測結(jié)果 例

3 討論

尿路上皮癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中位于第四位，僅次于前列腺癌（或乳腺癌）、肺癌及結(jié)直腸癌。尿路上皮癌可發(fā)生于下尿路（膀胱和尿道）以及上尿路（腎盂腎盞及輸尿管）。尿路上皮癌中，90%～95%為膀胱癌，膀胱癌是最常見的尿路惡性病變；而上尿路的腎盂癌及輸尿管癌較為少見，只占5%～10%。UTUC的發(fā)現(xiàn)可為偶發(fā)性或因相應(yīng)癥狀而得以診斷。70%～80%的UTUC病例最常見癥狀為肉眼血尿或鏡下血尿。與膀胱癌的自然病程明顯不同，UTUC臨床確診時60%的病例已具有浸潤性，而僅有15%～20%的膀胱癌發(fā)生上述改變[1]。因此，為及時制定適宜的治療方案，UTUC的早期診斷、病變分期及預(yù)后的正確評估具有非常重要的臨床意義。

目前，UTCU的診斷主要依靠尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和輸尿管鏡查。2013年最新版歐洲上尿路的尿路上皮癌診斷指南中，尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和CT尿路造影（CT urography，CTU）被列為A級建議，診斷性輸尿管鏡檢及活檢和逆行腎盂造影被列為C級建議[1]。然而，UTUC是一種復(fù)雜的異質(zhì)性腫瘤，涵蓋了從分化良好的淺表性病變到分化極差的浸潤性病變的多種病理變化，各類異常病變之間相差甚遠(yuǎn)。因此，上述診斷措施無法對UTUC提供完全準(zhǔn)確可靠的診斷依據(jù)，同時，在實際臨床應(yīng)用中均存在著不同程度的缺陷。以尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查為例，其敏感性較低，對于尿路上皮癌總敏感度為20%～30%[2]。同樣，作為有創(chuàng)操作，輸尿管鏡檢查不僅給患者造成痛苦甚至出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，而且往往無法發(fā)現(xiàn)扁平狀病變及原位癌[3，4]。此外，影像學(xué)檢查中的 CTU 等項目，由于受患者腎功能變化、腫瘤形態(tài)及大小等諸多因素的限制，亦不能單獨作為UTUC的診斷工具。

FISH是一種細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，可通過檢測尿脫落細(xì)胞的3、7、9、17號染色體數(shù)目異常用于UTUC的診斷。因其尿路上皮癌敏感性以及不同分期分級的尿路上皮癌敏感性均明顯高于傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查，已被美國食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)，將其UroVysion試劑盒用于膀胱癌診斷和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測、肉眼及鏡下血尿原因的篩查。目前，F(xiàn)ISH技術(shù)已日趨廣泛地應(yīng)用于膀胱癌的診斷中[2，3]。細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，UTUC的染色體核型的異常改變與膀胱癌相同[5]，這為FISH檢測UTUC提供了理論基礎(chǔ)。Marín-Aguilera等[3]及Akkad[6]較早將FISH技術(shù)用于 UTUC的研究。前者所入選的30例UTUC患者中，F(xiàn)ISH陽性23例，敏感性為76.7%，特異性為94.75%；而尿脫落細(xì)胞學(xué)的敏感性為36%，特異性為100%。后者發(fā)現(xiàn)FISH的UTUC敏感性為87.5%，細(xì)胞學(xué)則為60%，但FISH和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的特異性均為80%。近年來不斷有研究顯示FISH的UTUC敏感性明顯高于普通的尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，甚至其敏感性高達85%～100%，而尿細(xì)胞學(xué)檢查的結(jié)果僅為21%～24%[7，8]。此外，Xu等研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用FISH和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查無論對于浸潤性或非浸潤性腫瘤，均可使診斷UTUC的敏感性有單獨應(yīng)用FISH的79%提高到86%[9]。

本研究的101例UTUC病例中，高級別腫瘤56例，占總數(shù)的55%。浸潤性腫瘤60例，占全部病例的59%，這與文獻[1，3]報道的 UTUC多位高分級和高分期的結(jié)論相似。本組應(yīng)用FISH檢測UTUC的敏感性為54.5%，特異性為93.9%。與上述相關(guān)研究結(jié)果[3，6～9]比較，本組 FISH 的特異性與上述報道一致，但FISH的敏感性較低?？紤]本組FISH敏感性的差異可能與與下列因素有關(guān)：①相對上述各組實驗數(shù)據(jù)，雖然本組是例數(shù)最大的樣本，但本組病例多數(shù)為疑難病歷，典型的UTUC例數(shù)較少。推測若將典型病例行FISH檢測，敏感性可能會有所提高；②因經(jīng)濟因素以及患者依從性的差異等實際困難因素，本組所有受試患者只留取了一次尿液標(biāo)本，收集到腫瘤脫落細(xì)胞的概率相應(yīng)減小，因此可能導(dǎo)致FISH敏感性降低；③FISH敏感性與腫瘤病理分級呈正相關(guān)。本組FISH總的敏感性為54.5%；在56例高級別病例組中，33例呈FISH陽性，敏感率為58.9%，略高于本組總敏感率；而在21例低級別組中，敏感率僅為28.6%。

在 Xu等[9]的研 究中，F(xiàn)ISH 對于高級 別UTUC的敏感性為90.6%，低級別的敏感性為69.2%。Marín-Aguilera等的研究結(jié)果與Xu相似，在其高級別UTUC病例組中，F(xiàn)ISH的敏感性為86.4%，低級別組為50%[3]。上述FISH 敏感性在高級別與低級別UTUC的變化情況與本組的實驗結(jié)果相符。此外，上述研究顯示，在同一分期和同一分級的病變中，F(xiàn)ISH的敏感性均明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查。因已知尿脫落細(xì)胞學(xué)診斷UTUC的敏感性較低，本組實驗未行該項檢查并與FISH進行比較。

此外，本研究經(jīng)病理證實的10例腎細(xì)胞病例中，F(xiàn)ISH陽性4例，其中2例為透明細(xì)胞癌、另外2例為乳頭狀腎細(xì)胞癌，由此可推測FISH陽性并非為尿路上皮癌所特有。Reid-Nicholson等[10]認(rèn)為，腎細(xì)胞癌的某些染色體異常變化與尿路上皮癌存在相同之處，當(dāng)腎細(xì)胞癌侵犯腎盂進入到集合系統(tǒng)之后，可通過FISH技術(shù)檢測尿液中脫落的癌細(xì)胞已達到診斷目的，在其進一步的研究中，將39例腎細(xì)胞癌的蠟塊組織進行FISH檢測，發(fā)現(xiàn)15例（40%）FISH陽性，其中包括透明細(xì)胞癌、乳頭狀細(xì)胞癌、嫌色細(xì)胞癌以及肉瘤樣癌。FISH所檢測的是染色體異常的變化，無法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，因而不能鑒別尿路上皮癌與腎細(xì)胞癌，亦無法判定腫瘤細(xì)胞的分期和分級。除腎細(xì)胞癌之外，膀胱的非尿路上皮癌如鱗癌、原發(fā)或繼發(fā)性膀胱腺癌亦可呈FISH陽性變化[11]。FISH的這一特征提示病理醫(yī)師及泌尿外科醫(yī)師發(fā)現(xiàn)尿脫落細(xì)胞FISH陽性時，不應(yīng)只將解釋為尿路上皮癌，同時要注意非尿路上皮腫瘤的可能性，這將對治療方案的實施具有重要意義。

再有，在較少見情況下，UTUC可以合并原位癌，尿路上皮原位癌可使UTUC的復(fù)發(fā)率增高并促進病情發(fā)展[12]。Pieras等[13]發(fā)現(xiàn)，UTUC患者腎輸尿管全長切除術(shù)后膀胱癌的發(fā)生與合并上尿路的尿路上皮原位癌有關(guān)。Wheat等[14]通過分析行腎輸尿管全長切除術(shù)的患者資料發(fā)現(xiàn)，合并上尿路原位癌者術(shù)后復(fù)發(fā)率及腫瘤特異性死亡率均明顯增加。Youssef等[15]亦證實，既往有膀胱原位癌病史更易發(fā)生惡性程度較高的UTUC，而且行腎輸尿管全長切除術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率及腫瘤特異性死亡率均較高。以上研究表明，尿路上皮原位癌與UTUC的預(yù)后密切相關(guān)，對于既往有膀胱原位癌病史的患者，更應(yīng)密切隨訪，篩查上尿路原位癌及UTUC。文獻報道，尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查膀胱原位癌的敏感性為66%～83%[16]，而相應(yīng)一系列研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ISH的尿路上皮原位癌敏感性明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)[17，18]。同時，F(xiàn)ISH檢測尿路上皮癌蠟塊組織亦有較高的敏感性[19]。上述作者認(rèn)為，F(xiàn)ISH有望成為輔助尿脫落細(xì)胞學(xué)及組織活檢診斷尿路上皮原位癌的另一個重要手段。

本實驗所選病例均為臨床上復(fù)雜的疑難病例，所有全部病例的FISH檢測均因臨床工作中的實際需要而實施，典型的UTUC病例未入組，實驗結(jié)果可能會存在一定的偏差，F(xiàn)ISH敏感性低于其他研究組，對于單純評價FISH敏感性而言，這是本研究的不足之處。今后可將典型病例一同納入并與本組結(jié)果做進一步比較。

總之，F(xiàn)ISH作為一項無創(chuàng)檢查，因其較高的特異性以及優(yōu)于尿脫落細(xì)胞的敏感性，已成為診斷上尿路的尿路上皮癌的重要手段。同時，F(xiàn)ISH對于尿路上皮原位癌以及腎細(xì)胞等非尿路上皮癌的敏感性，有可能為實際臨床工作對于復(fù)雜UTUC的診斷、鑒別診斷以及相應(yīng)治療方案的制定提供新的思路和方法。

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