桔梗皂苷對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥保護(hù)作用的研究

★ 謝軼群 劉華 倪松石 (.如皋市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科 江蘇如皋6500;.南通大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 江蘇 南通6000)

支氣管哮喘是臨床常見病、多發(fā)病和難治病，是世界范圍內(nèi)最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，全球約有3億以上的人患哮喘，是世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，被世界衛(wèi)生組織列為疾病中四大頑癥之一。西醫(yī)盡管采用了吸入糖皮質(zhì)激素及支氣管舒張劑等藥物控制哮喘的急性發(fā)作和氣道的慢性炎癥，但由于治療周期長(zhǎng)、病人依從性差及藥物副作用等問題，使其臨床應(yīng)用受到一定的限制。中醫(yī)中藥由于取材方便、價(jià)格低廉、副作用少等優(yōu)點(diǎn)近年來受到臨床科研工作者及患者的青睞。桔梗在治療支氣管哮喘的中藥復(fù)方或湯劑中發(fā)揮著重要作用，然而桔梗治療支氣管哮喘的機(jī)制并未得到驗(yàn)證。研究者擬通過構(gòu)建支氣管哮喘的動(dòng)物模型，以地塞米松作為對(duì)照藥物研究桔梗皂苷對(duì)哮喘氣道炎癥的保護(hù)作用，初步揭示桔梗皂苷發(fā)揮臨床療效的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 BALB/c小鼠32只，清潔級(jí)，體重20～25g，雌性。購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心，動(dòng)物證號(hào)SCXKL(滬)2006－0003。

1.2 試劑 卵白蛋白(OVA)、乙酰膽堿(Ach)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、地塞米松(均為Sigma公司，美國(guó));桔梗皂苷、IL－4，IL－13試劑盒(均為Bisource公司，美國(guó))。

1.3 儀器 呼吸機(jī)及分析系統(tǒng)(北京新奧成科技有限公司);酶標(biāo)儀(Sunrise，奧地利);S－888E型超聲霧化器(南京道芬電子有限公司);熒光倒置顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(Carl Zeiss，德國(guó));動(dòng)物肺功能體描箱(北京新奧成科技有限公司);真空凍干機(jī)(LABCONCO，美國(guó))。

1.4 試驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)方法參照劉華［1］等的方法，將BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組，每組8只。分別為磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組(A組)，卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏組(B組)，OVA+桔梗皂苷組(C組)，OVA+地塞米松組(D組)。B、C、D三組小鼠分別于實(shí)驗(yàn)起始，第2周末和第3周末腹腔注射OVA和氫氧化鋁的混懸液200μL，第4周開始連續(xù)10d(每天20min)霧化吸入1%w/v OVA溶液;在此基礎(chǔ)上C組和D組小鼠分別予以灌胃桔梗皂苷25mg/kg和以腹腔注射的方式給予DXM5mg/Kg/d，連續(xù)10d。對(duì)照組小鼠以PBS作為對(duì)照。小鼠最后一次干預(yù)后一天予以麻醉后檢測(cè)肺功能及檢測(cè)灌洗液上清測(cè)白介素4，白介素13(IL－4、IL－13)，沉渣行瑞氏－吉姆薩染色做細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)，最后處死動(dòng)物取肺組織做病理形態(tài)學(xué)檢查。

1.4.1 哮喘小鼠氣道反應(yīng)性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，行氣管插管。小鼠尾靜脈穿刺，按照下述濃度梯度注入Ach，連接動(dòng)物肺功能儀，設(shè)置參數(shù):呼吸100次/分，潮氣量5－6mL/kg處理以不同濃度梯度Ach激發(fā)支氣管，以其肺阻力(lung resistance RL)表示氣道反應(yīng)性。Ach濃度分別為基線值以及 0.5，1.5，5，15，45g/L。

1.4.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)小鼠行氣管插管，支氣管肺泡灌洗，回收率約60%～70%，離心后取上清分裝保存待測(cè)IL－4、IL－13。沉渣行炎癥細(xì)胞的分類和計(jì)數(shù)。

1.4.3 BALF上清液 IL－4、IL－13測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 哮喘小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)檢查 小鼠處死后，取新鮮肺組織酒精固定，制備蠟塊，切片后常規(guī)蘇木精－伊紅染色(H＆E)染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，對(duì)本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性測(cè)定 見表1。

表1 各組小鼠氣道阻力比較(±s，n=8)

表1 各組小鼠氣道阻力比較(±s，n=8)

注:與A組比較，aP＜0.05;與 B組比較，bP＜0.05;與 C組比較，cP ＞0.05。

組別RL(cmH2O/mL/s)0.5g/L 1.5g/L 5g/L 15g/L 45g/L A 1.10±0.16 1.17 ±0.14 1.22±0.14 2.40±0.20 3.基線30 ±0.56 5.31 ±1.77 B 1.20±0.16 1.26 ±0.90 1.45±0.24 3.76 ±0.43a6.92±0.53a14.88 ±2.59a C 1.20±0.15 1.28 ±0.18 1.33±0.26 1.89±0.45b3.22±0.73b 7.76±1.43b D 1.15±0.18 1.18 ±0.36 1.17±0.35 1.78 ±0.16bc2.34±0.61bc4.56±1.98bc

2.2 BALF炎癥細(xì)胞的分類和計(jì)數(shù) 見表2。

表2 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(×109/L，±s，n=8)

表2 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(×109/L，±s，n=8)

注:與 A 組比較，aP＜0.05;與 B組比較，bP＜0.05;與 C比較，cP ＞0.05。

組別 嗜酸性粒細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 淋巴細(xì)胞A 0.89 ±0.16 2.89 ±2.34 16.28 ±1.99 2.25 ±0.74 B 84.25±6.78a 13.65 ±4.89a 21.75±2.45a 16.50 ±2.76a C 16.25 ±6.34b 8.50 ±2.86b 21.34 ±3.70 16.00 ±2.39 D 18.21±3.16bc 5.60 ±2.18bc 17.60±2.32b 4.50±0.95b

2.3 BALF細(xì)胞因子IL－4、IL－13檢測(cè)結(jié)果 見表3。

表3 各組小鼠IL－4、IL－13濃度比較(±s，n=8)/pg·mL－1

表3 各組小鼠IL－4、IL－13濃度比較(±s，n=8)/pg·mL－1

注:與A組比較，aP＜0.05;與 B組比較，bP＜0.05;與 C組比較，cP ＞0.05。

組別IL－4 IL－13 A 9.50 ±2.60 8.60 ±2.44 B 48.00 ±5.62a 63.36 ±8.39a 10.32 ±3.78b 11.33 ±2.90b D 11.39 ±3.80bc 28.00 ±5.380 C b

2.4 哮喘小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果

3 討論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，這種慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，氣道高反應(yīng)性是指氣道對(duì)各種特異性或非特異性刺激反應(yīng)性增高，以氣道平滑肌的過早或過強(qiáng)的收縮反應(yīng)、支氣管痙攣、黏液腺體分泌亢進(jìn)為主要臨床表現(xiàn)。

IL－4是B細(xì)胞刺激因子，其主要作用是誘導(dǎo)B細(xì)胞活化、增殖、分化及IgE的分泌，也可以直接誘導(dǎo)IgM或IgG轉(zhuǎn)化為IgE，IgE是哮喘發(fā)病過程中的重要抗體，IgE的過量產(chǎn)生，促使了I型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。IL－4能釋放IL－4到細(xì)胞外微環(huán)境，激活T細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL－4，能促使肥大細(xì)胞的增殖、分化、成熟，激活的肥大細(xì)胞，啟動(dòng)炎癥細(xì)胞募集、趨化［2］。IL－4是早期T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)啟動(dòng)因素，并對(duì)嗜酸粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞有強(qiáng)大的化學(xué)趨化作用，可顯著增加氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞的聚集、活化，增強(qiáng)氣道高反應(yīng)性［3］。IL－13與IL－4由相同細(xì)胞產(chǎn)生，它們具有共同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)途徑也相同，有相似的生物學(xué)活性，是可以直接促進(jìn)IgE合成的細(xì)胞因子之一［4］。IL－13在所有與哮喘有關(guān)的細(xì)胞因子中占具重要的地位，可以在沒有其他細(xì)胞因子的情況下，單獨(dú)介導(dǎo)引起哮喘。IL－13可引起嗜酸粒細(xì)胞聚集，黏液分泌增加，導(dǎo)致氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性，在氣道重塑中起著重要作用，是形成氣道高反應(yīng)性所必需的細(xì)胞因子。有研究顯示，在IL－13缺如時(shí)，即使有大量的IL－4、IL－5以及明顯的氣道嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道高反應(yīng)性也不能產(chǎn)生［5］。

本研究通過建立哮喘小鼠模型，應(yīng)用桔梗皂苷進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)氣道炎癥的保護(hù)作用及可能機(jī)制。結(jié)果表明，哮喘小鼠存在嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、IL－4、IL－13表達(dá)的上調(diào)，桔梗皂苷可抑制哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)，降低氣道阻力。抑制嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、IL－4、IL－13的表達(dá)可能是其機(jī)制之一。但其具體作用機(jī)制尚未十分清楚，還需要進(jìn)一步深入探討。

［1］劉華.β2腎上腺素能受體減敏及其激素保護(hù)作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］.南京:南京醫(yī)科大學(xué)，2008.

［2］Ochi H，Hirani WM，Yuan Q，et al.T helper cell type 2 cytokine －mediated comitogenic responses and CCR3 expression during differentiation of human mast cells in vitro［J］.Exp Med，1999，190(2):267－280.

［3］楊學(xué)敏，史孩廣，成家軍，等.白介素4在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用及其靶向治療研究［J］.中華哮喘雜志，2011，5(2):112－116.

［4］范新蕾，田鋒，田洪德.白介素與支氣管哮喘相關(guān)關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.臨沂醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2005，27(1):45 －47.

［5］David M，walter JJ，Mcintire GB，et al.Critical role of IL － 13 in the development of allergen－induced airway hyperreactivity［J］.Immunol，2001，167(8):4 668 －4 675.