水蛭提取物對HL60細胞增殖與細胞周期的影響

★ 肖移生 侯吉華 李青 汪建民＊ (江西中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 江西 南昌330004)

中藥水蛭性咸、苦、平，歸肝、膀胱經(jīng)，有破血瘀、散結(jié)聚、通經(jīng)脈、利水道等功效，用于治癥瘕、痞塊、血瘀閉經(jīng)、跌打損傷等，其藥理作用為抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等［1］;臨床上水蛭也可單方或組方運用于腫瘤治療中［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)水蛭提取物對HL60細胞生長有抑制作用［3］，為進一步探討，本課題組進行了水蛭提取物對HL60細胞增殖與細胞周期影響的實驗。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養(yǎng)方法 HL60細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心，由江西中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗中心保存，將HL60細胞培養(yǎng)于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中(37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng))，培養(yǎng)至細胞處于對數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基及新生小牛血清為美國GIBCO公司產(chǎn)品;全反式維甲酸(All transretinoic acid，ATRA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、佛波酯(TPA)、碘化丙啶(PI)、RNase A均為美國Sigma公司產(chǎn)品;鼠抗人Cyclin E、CDK2抗體均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品;HRP標記的羊抗鼠IgG二抗、GAPDH內(nèi)參抗體均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。其余未說明的試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.3 藥物 水蛭原藥材購于江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)我校中藥資源學科組鄧可眾副教授鑒定且符合國家中藥臨床應(yīng)用標準。水蛭用超微粉碎機粉碎，提取物以液氮快速凍融法制備［4］:取水蛭超微粉1.5g置15mL離心管內(nèi)，加10mL無菌雙蒸水制成混懸液，再將離心管置液氮內(nèi)5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重復(fù)3次，再3000r/min離心10min。取上清液過濾，濾液冷凍干燥18h即得水蛭凍干粉，－20℃保存?zhèn)溆?，臨用前用培養(yǎng)基配成實驗所需濃度工作液，再經(jīng)0.22um無菌濾器正壓過濾除菌。

1.4 MTT試驗 取對數(shù)生長期的HL60細胞以5.0×104/mL細胞濃度置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，同時用水蛭提取物(根據(jù)前期實驗結(jié)果［3］，設(shè) 0.7、1.4、2.8g/L，為水蛭提取物凍干粉的劑量)再處理HL60細胞48h，同時設(shè)正常對照孔及陽性藥物(ATRA)對照，到時間點后各孔加入MTT液20μL/孔，每組10個復(fù)孔，4h后終止培養(yǎng)，以1000r/min離心5min，去除上清，加入 DMSO(150 μL/孔)使結(jié)晶物溶解，用自動酶標儀波長490nm處測吸光度A值，實驗重復(fù)5次，得出量效關(guān)系。按下列公式計算細胞抑制率:細胞生長抑制率(%)=(對照孔A值－試驗孔A值)/對照孔A值×100%。

1.5 FCM檢測HL60細胞周期 收集各組細胞，每組細胞數(shù)約2.0×106個，離心后棄上清，用冷PBS漂洗，加冷70%乙醇固定，4℃過夜;次日離心后棄乙醇，用PBS漂洗2遍，加入 PI(100ug/mL)10μL、RNase A(5ug/mL)10μL、并加入PBS液至總體積達500μL，于室溫下避光作用30min，然后上流式細胞儀(FCM)行細胞周期檢測。實驗重復(fù)10次。

1.6 Western blotting法檢測Cyclin E、CDK2 蛋白表達 按照操作說明，用裂解液提取組織總蛋白;BCA法測總蛋白質(zhì)濃度，8%SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜;室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h;然后加一抗(Cyclin E和 CDK2;均為1∶400濃度)，同時以GAPDH(1∶500)為內(nèi)參，4℃孵育過夜;次日加入HRP標記的羊抗鼠IgG二抗(1∶500)，室溫孵育1h;再用化學發(fā)光液在暗室進行曝光顯影。實驗重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 水蛭提取物對HL60細胞增殖的抑制作用各濃度的水蛭提取物處理HL60細胞48h后，MTT檢測結(jié)果顯示水蛭提取物以劑量依賴性方式抑制HL60細胞增殖，抑制率隨水蛭提取物濃度增高而增加。各試驗組與正常組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05，P ＜0.01)，見表1。

表1 水蛭提取物對HL60細胞增殖的抑制作用(±s，n=50)

表1 水蛭提取物對HL60細胞增殖的抑制作用(±s，n=50)

注:與正常組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 濃度 吸光度 抑制率(%)－ 0.642 ±0.017 －水蛭提取物組 0.7g/L 0.401 ±0.012* 37.89 1.4g/L 0.285 ±0.011＊＊ 55.46 2.8g/L 0.232 ±0.009＊＊ 63.25 ATRA組正常對照組2umol/L 0.273 ±0.009 57.45

2.2 水蛭提取物對 HL60細胞周期的影響 經(jīng)FCM分析細胞周期結(jié)果顯示，水蛭提取物對HL60細胞周期的分布有顯著性影響。隨藥物濃度增高，G1期比例增高，S期比例下降，各藥物組與正常對照組的G1/G0期、S期比例比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05，P ＜0.01);各組 G2期比例變化不大，無統(tǒng)計學差異，見表2、圖1。

表2 水蛭提取物對HL60細胞周期的影響(±s，n=50)

表2 水蛭提取物對HL60細胞周期的影響(±s，n=50)

注:與正常組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 濃度 G1期(%) S期(%) G2/M期(%)－ 34.75±5.38 53.64 ±6.77 11.14±0.89水蛭提取物組 0.7g/L 45.21±8.17* 45.93±4.16* 15.20±1.86 1.4g/L 52.21±6.32＊＊ 40.22±3.60＊＊ 13.26±0.55 2.8g/L 60.58±7.26＊＊ 30.81±4.37＊＊ 10.66±1.21 ATRA組正常對照組2umol/L 62.49±6.45 32.16 ±2.48 14.32±0.99

2.3 水蛭提取物對HL60細胞Cyclin E、CDK2蛋白表達的影響 Western blotting法檢測各組細胞Cyclin E、CDK2蛋白表達發(fā)現(xiàn)，與正常對照(Control)組相比，水蛭中劑量及高劑量處理的兩組HL60細胞其Cyclin E、CDK2蛋白的表達顯著降低，且劑量越高，其抑制效果越明顯(圖2)。

圖1 FCM檢測各組HL60細胞周期圖

圖1 Western blotting檢測各組細胞Cyclin E、CDK2蛋白表達

3 討論

水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有破血、逐瘀、通經(jīng)等功效，廣泛用于心腦血管及血栓性疾病的治療，水蛭也是腫瘤疾病治療中常用的一味活血藥。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)水蛭抗腫瘤的主要活性成份有凝血酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等，含量中主要是水蛭素、溶纖素等［5］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)HL60細胞經(jīng)過72h完成對數(shù)生長期，然后達到平臺期;水蛭提取物濃度高于0.1mg/mL時對HL60細胞有明顯的抑制作用，并呈時間和劑量依賴性，且以48h達最佳藥效作用時間;經(jīng)計算作用HL60細胞48h時的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故本研究中將水蛭提取物設(shè)為 0.7、1.4、2.8g/L(低、中、高劑量)三個劑量作用 HL60 細胞48h時間段進行研究［3］。

我們的實驗表明，水蛭提取物有良好的抑制HL60細胞增殖作用，2.8g/L的水蛭提取物抑制HL60細胞增殖率達62.25%。經(jīng)FCM分析細胞周期結(jié)果顯示，水蛭提取物對HL60細胞周期的分布有顯著性影響，隨藥物濃度增高，G1期比例增高，S期比例下降，但對G2期比例變化不大，這說明水蛭提取物能阻滯HL60細胞于細胞分裂周期的G1期、阻止進入S期。有研究證實，細胞周期長短主要決定于G1期，G1期阻滯可使細胞周期延長，導(dǎo)致細胞增殖減慢［6］。所以，水蛭提取物具有良好的抑制HL60細胞增殖作用與細胞周期G1期阻滯有關(guān)。

細胞周期有兩個限制點，分別是G1/S期及G2/M期，其中G1/S期是啟動細胞周期的關(guān)鍵，而Cyclin E又是調(diào)節(jié)細胞周期從G1期向S期過渡的關(guān)鍵因子［7］。CDK2是CDK家族成員之一，可與Cyclin E結(jié)合形成功能性復(fù)合物，促進細胞周期由G1期向S期過渡，細胞呈現(xiàn)旺盛的增殖能力［8］。筆者運用Western blotting法檢測各組細胞Cyclin E、CDK2蛋白表達發(fā)現(xiàn)，水蛭提取物能顯著降低HL60細胞的Cyclin E、CDK2蛋白表達，且劑量越高，其抑制效果越明顯。這就進一步驗證了水蛭提取物抑制HL60細胞增殖是將其細胞周期阻滯于G1期，但其詳細機制有待深入研究。

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