大蒜素對(duì)辣椒炭疽病和辣椒疫病病菌的室內(nèi)抑制活性測(cè)定及田間防效研究

周清，李保同，湯麗梅

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西 南昌330045）

辣椒炭疽?。–olletotrichum capsici）和辣椒疫?。≒hytophthora capsici）是辣椒（Capsicum annuum）生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重的世界性病害。辣椒炭疽病病原菌可通過(guò)種子、土壤和病株殘?bào)w侵染，引起辣椒落葉、爛果和幼苗死亡，對(duì)辣椒的產(chǎn)量、品質(zhì)和貯藏產(chǎn)生很大的影響［1］。辣椒疫病是一種毀滅性土傳卵菌病害，其病原菌可侵染辣椒、茄子（Solanum melongena）、番茄（Lycopersicon esculentum）、黃瓜（Cucumis sativus）等作物，危害辣椒的根、莖、葉和果實(shí)等部位，在氣候條件適宜的情況下，短期內(nèi)就可爆發(fā)蔓延，給辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［1］。目前，化學(xué)防治仍是辣椒炭疽病和辣椒疫病的主要防治措施，這不僅易造成蔬菜和環(huán)境污染，還易誘發(fā)病原菌的抗藥性［2-5］。為尋求安全有效的防治措施，利用生物農(nóng)藥防治辣椒病害，減少農(nóng)藥殘留，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，越來(lái)越引起人們的關(guān)注。植物是生物活性化合物的天然寶庫(kù)，各類植物中含有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的次生代謝產(chǎn)物，其中生物堿類、萜烯類、黃酮類、檸檬素和番荔枝內(nèi)酯等化合物都具有較強(qiáng)的抑菌活性［6-7］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，金銀花（Lonicera japonica）、板藍(lán)根（Isatis tinctoria）、黃芩（Scutellaria baicalensis）、苦參（Sophoraflavescens）、丁香（Syzygium aromaticum）、烏梅（Prunus mume）、百部（Stemona sessilifolia）、桂枝（Cinnamomum cassia）等植物提取物以及枯茗酸、茶皂素、小蘗堿、芳樟醇、香茅醛等植物次生代謝產(chǎn)物對(duì)辣椒炭疽病和疫病菌具有良好的抑制活性和田間防治效果［8-13］。

大蒜素（allicin）又名大蒜新素，化學(xué)名稱為二烯丙基三硫化物（CH2＝CH－CH2－S－S－S－CH2－CH＝CH2），是從蒜（Allium sativum）的球形鱗莖中提取的揮發(fā)性油狀物，被譽(yù)為天然廣譜抗生素，已廣泛用于抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、福氏痢疾桿菌（Shigella flexne-ri）、宋氏痢疾桿菌（Shigella sonnei）、傷寒桿菌（Salmonella enterica）、大腸桿菌（Escherichia coli）等病菌和心血管等疾病的防治［14-16］。關(guān)于大蒜素在作物上的應(yīng)用研究，孫惠敏等［17］報(bào)道大蒜素對(duì)柑橘潰瘍病病原細(xì)菌（Xanthomonas cam pestris）的抑制活性，有研究［18-20］報(bào)道大蒜素對(duì)棉花致病菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、棉花串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme）、棉花尖鐮孢萎蔫?；驼婢‵usarium oxysporum）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄葉霉病菌（Fulvia fulva）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）等病原真菌抑制效果，由此證實(shí)大蒜素具有抑制植物病原細(xì)菌和真菌廣譜的特性。而有關(guān)大蒜素對(duì)辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌的抑制作用報(bào)道較少。本文研究了大蒜素對(duì)辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生和孢子萌發(fā)的抑制作用及其田間防治效果，以期為大蒜素在蔬菜上的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥劑：98%大蒜素精油，由陜西慈緣生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，溶于甲醇配制成12 mg／m L的母液；加復(fù)合氨基酸、月桂酸甲酯、乳化劑Termul 5030、乙二醇和去離子水等助劑，配制成6%大蒜素水乳劑；98%多菌靈（carbendazim）原藥由山東華陽(yáng)科技股份有限公司生產(chǎn)，溶于甲醇配制成10 mg／m L的母液；50%多菌靈可濕性粉劑由江陰市福達(dá)農(nóng)化有限公司生產(chǎn)。

儀器：電子天平（感量0.1 mg）、光照培養(yǎng)箱、移液槍、卡尺、錐形瓶、玻璃棒、培養(yǎng)皿（Ф＝90 mm）、打孔器（Ф＝6 mm）、接種器、血球計(jì)數(shù)板、凹玻片、載玻片等。

菌株：辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)轉(zhuǎn)接、純化培養(yǎng)后供試。

培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA），稱取200 g馬鈴薯置于1000 m L蒸餾水中，煮沸30 min，過(guò)濾，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂，融化后用蒸餾水補(bǔ)足至1000 m L，分裝滅菌（126℃，25 min），備用。玉米粉培養(yǎng)基（CMA）：稱取玉米粉300 g置于1000 m L蒸餾水中，60℃水浴加熱1 h，過(guò)濾，加入16 g瓊脂，用蒸餾水補(bǔ)足至1000 m L，分裝滅菌（126℃，25 min），備用。

1.2 方法

1.2.1 藥劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇各藥劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率在10%～90%范圍內(nèi)的5個(gè)濃度，用甲醇將藥劑配成一定濃度的母液，按照體積比1∶100的比例分別加入到已融化并冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后分別倒入4個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，制成系列濃度的含藥培養(yǎng)基（即大蒜素50.0，66.7，100.0，200.0，600.0μg／m L，多菌靈1000μg／m L），以加入等體積甲醇的 PDA 平板為對(duì)照［21-22］。用打孔器截取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的待用病原菌菌餅，菌絲面朝上接種于已凝固的含藥PDA培養(yǎng)基中央，置于25℃下黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照菌落直徑長(zhǎng)至大于平皿直徑2／3時(shí)，用卡尺測(cè)量菌落直徑（mm）。每個(gè)菌落用十字交叉法垂直測(cè)量直徑各1次，取其平均值。每處理重復(fù)3次，與對(duì)照比較計(jì)算各藥劑處理對(duì)菌落擴(kuò)展的生長(zhǎng)抑制率，分析比較供試藥劑對(duì)供試病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。以藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，菌絲生長(zhǎng)抑制率的幾率值為縱坐標(biāo)，采用回歸分析法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算各處理的EC50值、EC90值及其95%置信限。

1.2.2 藥劑對(duì)病原菌孢子產(chǎn)生的影響 用打孔器截取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的待用病原菌菌餅，菌絲面朝上接種于已凝固的含藥PDA（炭疽病菌培養(yǎng)）或CMA（疫病菌培養(yǎng)）培養(yǎng)基中央，以無(wú)藥劑的培養(yǎng)基為對(duì)照。接種的PDA培養(yǎng)基于30℃下連續(xù)光照培養(yǎng)7 d后，加入40 m L無(wú)菌水，用毛筆刷洗培養(yǎng)基表面的孢子，過(guò)濾。接種的CMA培養(yǎng)基于26℃下黑暗培養(yǎng)3 d后，繼續(xù)光照培養(yǎng)6 d，在培養(yǎng)基中加入40 m L無(wú)菌水于16℃下再光照培養(yǎng)0.5 h后，用毛筆刷洗培養(yǎng)基表面的孢子，過(guò)濾。用血球計(jì)數(shù)板在10×10倍視野下鏡檢孢子的數(shù)量，每菌餅隨機(jī)檢測(cè)4視野。每處理重復(fù)3次，與對(duì)照比較計(jì)算各藥劑對(duì)孢子產(chǎn)生的抑制率，分析供試藥劑對(duì)供試病原菌孢子產(chǎn)生的影響。

1.2.3 藥劑對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響 按1.2.2無(wú)藥劑對(duì)照操作方法產(chǎn)生的孢子，用滅菌水稀釋至1×105～1×107個(gè)孢子／m L，并加入0.5%葡萄糖溶液，備用。在無(wú)菌條件下將6%大蒜素水乳劑用無(wú)菌水配成一定濃度的母液，用移液槍從低濃度到高濃度依次吸取0.5 m L母液分別加入小試管中，再吸取制備好的孢子懸浮液0.5 m L使藥液與孢子懸浮液等量混合均勻，配置成試驗(yàn)所需濃度。用微量加樣器吸取藥劑孢子混合液滴至凹玻片上，將凹玻片架放于帶有淺層水的培養(yǎng)皿中，于25℃下光照靜置2 h。每處理重復(fù)3次，并設(shè)不含藥劑的處理作對(duì)照。當(dāng)對(duì)照孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時(shí)，在10×10倍視野下鏡檢孢子萌發(fā)的情況，孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子的半徑視為萌發(fā)。每處理隨機(jī)觀察4個(gè)視野，記錄孢子總數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)。每處理重復(fù)3次，與對(duì)照比較計(jì)算各藥劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率，分析供試藥劑對(duì)供試病原菌孢子萌發(fā)的影響。

1.2.4 藥劑對(duì)辣椒炭疽病和疫病的田間防治效果 試驗(yàn)于2011年在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園保護(hù)地辣椒上進(jìn)行，土壤有機(jī)質(zhì)含量2.15%，p H值5.8，肥力中等。供試?yán)苯菲贩N為湘研19號(hào)，2月12日定植，株行距40 cm×60 cm。試驗(yàn)設(shè)6%大蒜素水乳劑66.7，100.0，200.0，600.0，1200.0μg／m L，50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L和清水對(duì)照，共7個(gè)處理，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積20 m2。于辣椒苗期，即3月7，17，27日連續(xù)噴藥3次防治疫病；于辣椒掛果期，即5月9，19，29日連續(xù)噴藥3次防治炭疽病，藥液用量450 kg／hm2。第1次施藥前調(diào)查病情基數(shù)，最后1次藥后3，7，14 d分別調(diào)查1次病害的防治效果。病情調(diào)查、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及藥效計(jì)算參照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》（一）有關(guān)方法進(jìn)行［23］，用Duncan氏方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，比較各處理間的差異。

辣椒果實(shí)炭疽病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積的2%以下；3級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積的3%～8%；5級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積的9%～15%；7級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積的16%～25%；9級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的25%以上。

辣椒植株疫病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)癥狀；1級(jí)，地上部?jī)H葉、果有病斑；3級(jí)，地上莖、枝有褐腐斑；5級(jí)，莖基部有褐腐斑；7級(jí)，地上莖、枝與莖基部均有褐腐斑，且部分枝條枯死；9級(jí)，全株枯死。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥劑對(duì)病原菌的抑制作用

2.1.1 對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 大蒜素在供試濃度內(nèi)對(duì)辣椒炭疽病菌和疫病菌菌絲生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，其抑制活性與濃度呈正相關(guān)，200～600μg／m L處理對(duì)炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果為71.17%～78.06%，與對(duì)照藥劑多菌靈1000μg／m L處理無(wú)顯著差異，對(duì)疫病菌絲生長(zhǎng)的抑制效果為71.39%～78.23%，顯著低于對(duì)照藥劑多菌靈1000μg／m L處理（表1）。大蒜素對(duì)炭疽病菌和疫病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度（EC50）分別為130.15和128.11μg／m L，EC90值分別為992.26和988.74μg／m L（表2）。

2.1.2 對(duì)病原菌產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的抑制作用 不同濃度的大蒜素（50～600μg／m L）均對(duì)辣椒炭疽病菌和疫病菌產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用，其抑制活性與濃度呈正相關(guān)，600μg／m L處理對(duì)炭疽病菌產(chǎn)孢的抑制效果為81.16%，顯著高于對(duì)照藥劑多菌靈1000μg／m L處理，對(duì)炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制效果為83.72%，與對(duì)照藥劑無(wú)顯著差異；600μg／m L處理對(duì)疫病菌產(chǎn)孢的抑制效果為88.23%，顯著低于對(duì)照藥劑多菌靈1000 μg／m L處理，對(duì)疫病菌孢子萌發(fā)的抑制效果為84.40%，顯著高于對(duì)照藥劑（表1）。大蒜素對(duì)炭疽病菌產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)EC50值分別為142.60和127.21μg／m L，EC90值分別為936.20和836.82μg／m L，對(duì)疫病菌產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)EC50值分別為123.64和139.68μg／m L，EC90值分別為450.01和729.05μg／m L（表2）。

表1 大蒜素對(duì)辣椒炭疽病菌和疫病病原菌的抑制效果Table 1 Inhibitive effects of allicin on pathogenic fungi of C.capsici and P.capsici

表2 大蒜素對(duì)辣椒炭疽病和辣椒疫病病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果Table 2 Toxicity efficiency of allicin on pathogenic fungi of C.capsici and P.capsici in the greenhouse

2.2 大田防治試驗(yàn)

2.2.1 大蒜素對(duì)辣椒炭疽病防效 大蒜素對(duì)辣椒炭疽病具有良好的防治效果，600～1200μg／m L處理第3次藥后3，7，14 d對(duì)辣椒炭疽病的防效為83.54%～88.25%，82.01%～86.17%和74.59%～79.16%，與對(duì)照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L處理無(wú)顯著差異；66.7～200.0μg／m L處理第3次藥后3～14 d對(duì)辣椒炭疽病的防效均低于76%，極顯著低于對(duì)照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L處理（表3）。

2.2.2 大蒜素對(duì)辣椒疫病防效 大蒜素對(duì)辣椒疫病具有良好的防治效果，600～1200μg／m L處理第3次藥后3，7，14 d對(duì)辣椒疫病的防效分別為82.85%～85.88%，79.91%～83.37%和74.59%～78.01%，與對(duì)照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L處理無(wú)顯著差異；66.7～200.0μg／m L處理藥后3～14 d對(duì)辣椒疫病的防效均低于76%，極顯著低于對(duì)照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L處理（表4）。

表3 大蒜素對(duì)辣椒炭疽病的田間防治效果Table 3 Field efficacy of allicin on C.capsici

表4 大蒜素對(duì)辣椒疫病的田間防治效果Table 4 Field efficacy of allicin on P.capsici

3 結(jié)論與討論

通過(guò)室內(nèi)抑菌活性測(cè)定表明，大蒜素可有效抑制辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生和孢子萌發(fā)，其EC50值均在142.60μg／m L以下，EC90值均在1159.66μg／m L以下；通過(guò)田間試驗(yàn)表明，6%大蒜素水乳劑對(duì)辣椒炭疽病和辣椒疫病具有較好的防治效果，600～1200μg／m L處理第3次藥后3 d防效均在82.85%以上，第3次藥后14 d防效均在74.59%以上。因此，6%大蒜素水乳劑具有在辣椒炭疽病和辣椒疫病防治上推廣應(yīng)用的價(jià)值。用6%大蒜素水乳劑防治辣椒炭疽病和辣椒疫病的推薦使用劑量為600～1200μg／m L，建議在辣椒苗期和掛果期連續(xù)噴施3次，每隔10 d噴施1次。

辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌侵入植物體內(nèi)的一般過(guò)程是分生孢子（疫病為卵孢子）通過(guò)風(fēng)雨等傳播落在辣椒植株表面，在潮濕條件下萌發(fā)形成芽管和附著孢子侵入寄主組織，然后擴(kuò)展形成菌絲發(fā)?。?4］。本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對(duì)辣椒炭疽病菌和疫病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生和孢子萌發(fā)有抑制作用；田間試驗(yàn)結(jié)果表明，大蒜素對(duì)辣椒炭疽病和疫病有較好的防治效果，并具有一定的持效期。這表明大蒜素對(duì)辣椒炭疽病菌和疫病菌的侵入和擴(kuò)展均可能產(chǎn)生不同程度的影響。殺菌劑對(duì)病原菌的作用機(jī)制有多種，如抑制真菌細(xì)胞壁形成和質(zhì)膜生物合成，抑制呼吸作用，抑制甾醇生物合成（SBI）及其合成過(guò)程中的脫甲基（DMI），增加線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等［25］。大蒜素的生物活性主要來(lái)源于它與含巰基化合物的相互作用和抗氧化能力，其抗菌的機(jī)理可能是對(duì)乙酰輔酶A的抑制作用［26-27］。有關(guān)大蒜素的抑菌抗病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

大蒜素對(duì)植物病原菌的抑制活性存在差異。宋興舜等［19］報(bào)道大蒜素原藥33～100μg／m L對(duì)番茄早疫病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率為28.70%～76.00%，72～143μg／m L對(duì)番茄葉霉病菌和番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別為34.12%～74.07%和51.77%～83.32%；蔣家珍等［18］報(bào)道5%大蒜素乳油對(duì)棉花立枯絲核菌、棉花串珠鐮孢菌和棉花尖鐮孢萎蔫專化型真菌菌絲生長(zhǎng)EC50值分別為19.40，7.10和20.60μg／m L。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌EC50值分別為130.15和128.11μg／m L，EC90值分別為992.26和1159.66μg／m L，這與前人報(bào)道的結(jié)果存在較大差異，其原因可能與供試的藥劑來(lái)源和靶標(biāo)種類不同有關(guān)。在新鮮大蒜中沒(méi)有游離的大蒜素，其前體為蒜氨酸和蒜酶，自然狀況下獨(dú)立穩(wěn)定地存在于鱗莖中。當(dāng)大蒜經(jīng)加工或受到物理機(jī)械破碎后，大蒜中被激活的蒜酶催化分解蒜氨酸，生成具有揮發(fā)性的大蒜素［28］。現(xiàn)代研究認(rèn)為，大蒜素是具有生物活性的亞砜和砜類化合物成分的總稱，其主要成分為二烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫酸、二烯丙基硫代亞磺酸酯和甲基烯丙基三硫醚［28］。曾東方等［20］報(bào)道大蒜乙醇萃取物20000μg／m L對(duì)稻瘟病菌、小麥紋枯病菌、油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果分別達(dá)到70.60%，83.60%和94.30%，張萬(wàn)萍和趙麗［29］報(bào)道大蒜水和乙酸乙酯提取物對(duì)辣椒疫病菌菌絲生長(zhǎng)的最低抑菌濃度為5000μg／m L，與本試驗(yàn)結(jié)果比較活性明顯偏低，其原因可能是大蒜提取物中活性成分含量偏低所致。