雷公藤多苷對(duì)糖尿病腎病大鼠的抗氧化應(yīng)激作用

張玉霞，劉國(guó)玲，王家勤，李宜川，胡靈衛(wèi)，蘆 琨

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003;2.商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南商丘 476100;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

糖尿病性腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮非常重要的作用。雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii polyglycoside，TWP)是從雷公藤植物中提取的總苷，其主要成分為環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物。研究報(bào)道，TWP具有抑制細(xì)胞和體液免疫功能的作用，從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制免疫應(yīng)答過(guò)程［1］。本研究通過(guò)觀察TWP對(duì)DN大鼠血清過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性和超氧陰離子()含量及腎組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的影響，探討TWP對(duì)DN大鼠腎的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和主要儀器

Sprague-Dawley(SD)大鼠85只，雄性，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(鄂)2011-0007。TWP購(gòu)于上海融合有限公司，純度98.7%;鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)由美國(guó)Sigma公司提供，臨用前用枸櫞酸緩沖液 0.1 mol·L－1溶解(pH 4.2);血糖、肌酐清除率(creatinine clearance rate，Clcr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、24 h尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)試劑盒均購(gòu)于中生北控生物科技股份有限公司;GSHPx，MDA，和CAT試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。Accu-Chek型血糖儀及血糖試紙(德國(guó)羅氏公司)，7600型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，500型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 糖尿病性腎病模型的制備和給藥

85只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組(13只)和DN模型組(72只)。模型組單次ip給予STZ 52 mg·kg－1，正常對(duì)照組 ip給予等體積0.1 mol·L－1枸櫞酸緩沖液。注射 STZ 72 h 后，尾靜脈采血測(cè)空腹血糖并同時(shí)測(cè)尿糖，空腹血糖≥16.7 mmol·L－1、尿糖(++)以上為糖尿病模型制備成功。參照文獻(xiàn)［2］，DM造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)3周，以 3 周后空腹血糖≥16.7 mmol·L－1，尿糖+++以上、尿量大于造模前50%且24 h尿白蛋白大于造模前的50%為DN模型制備成功。將56只DN造模成功的大鼠隨機(jī)分為DN模型對(duì)照組及 TWP 4.5，9.0 和18.0 mg·kg－1組，每組14 只。TWP組ip給予TWP混懸液，正常對(duì)照組和DN模型對(duì)照組ip給予等體積飲用水，每天上午給藥1次，連續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水，正常飲食，不給予胰島素及其他降糖藥物。

1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

用藥8周末稱大鼠體質(zhì)量，ip給予10%水合氯醛300 mg·kg－1麻醉，打開(kāi)腹腔，心臟取血，離心留取血清，－20℃保存。采用血糖儀測(cè)定血糖;全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血BUN，Scr和Ucr水平，應(yīng)用公式計(jì)算，Clcr=(Ucr×每分鐘尿量)/Scr。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前2 d將大鼠置代謝籠，收集24 h尿液，離心，取上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)24 h UAER。

1.4 腎組織GSH-Px活性和 MDA含量及血清CAT活性和含量的測(cè)定

用藥8周末，取左腎凍存。測(cè)定前取凍存的腎組織，用冷生理鹽水制成10%的勻漿，硫代巴比妥酸縮合法檢測(cè)MDA含量，比色法測(cè)定GSH-Px活性。取保存的血清，可見(jiàn)光方法檢測(cè)過(guò)CAT活性，比色法測(cè)定水平。以上各指標(biāo)都按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 腎組織病理變化觀察

用藥8周末，取右腎，腎組織切成8 mm3小塊，甲醛固定，切片，HE染色觀察組織病理改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TWP對(duì) DN大鼠血糖、Clcr、BUN和 24 h UAER的影響

由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組空腹血糖、BUN和 UAER均顯著增高(P＜0.01)，Clcr明顯降低(P＜0.01);與模型對(duì)照組相比，TWP 3個(gè)劑量組血糖無(wú)明顯改變，BUN和UAER均顯著降低(P ＜0.01)，Clcr明顯升高(P ＜0.01)。

Tab.1 Effect of Tripterygium wilfordii polyglycoside(TWP)on glucose，creatinine clearance rate(Clcr)，blood urea nitrogen(BUN)and 24 h urine albumin excretion rate(24 h UAER)of diabetic nephropathy(DN)model rats

Tab.2Effect of TWP on catalase(CAT)activity and superoxide anion()content in serum and glutathione peroxidase(GSH-Px)activity and malondialdehyde(MDA)content in renal tissue of DN rats

Tab.2Effect of TWP on catalase(CAT)activity and superoxide anion()content in serum and glutathione peroxidase(GSH-Px)activity and malondialdehyde(MDA)content in renal tissue of DN rats

See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=13 －14.＊＊P ＜0.01，compared with normal control group;##P ＜0.01，compared with model control group.

GroupCAT/U·L－1O÷2/kU·L－1MDA/mmol·g－1GSH-Px/kU·g －1 Normal control 602 ±153 71 ±15 2.51 ±0.15 59 ±6 Model 232 ±100＊＊ 125 ±12＊＊ 3.64 ±0.18＊＊ 40 ±4＊＊Model+TWP 4.5 301 ±82 108 ±18 3.32 ±0.21 44 ±3 9.0 399 ±79## 94 ±20## 3.15 ±0.05## 50 ±6##18 487 ±127## 86 ±18## 3.01 ±0.09## 52 ±5##

2.2 TWP對(duì)DN大鼠血清CAT活性和含量及腎組織GSH-Px活性和MDA含量的影響

由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清CAT活性和腎組織中GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)，血清水平和腎組織MDA含量明顯升高(P＜0.01);與模型對(duì)照組相比，TWP 9.0和18 mg·kg－1組血清 CAT活性和腎組織中GSH-Px活性明顯升高(P＜0.01)，血清水平和腎組織MDA含量明顯降低(P＜0.01)。

2.3 TWP對(duì)DN大鼠腎組織病理變化的影響

由圖1可見(jiàn)，正常對(duì)照組腎小球毛細(xì)血管腔均勻一致，無(wú)狹窄，腎小管間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A);模型對(duì)照組腎小球肥大、系膜細(xì)胞增生、腎小球變形(圖1B);TWP 9 和18 mg·kg－1與模型對(duì)照組相比上述病變明顯減輕(圖1D和 E)，18 mg·kg－1組更加明顯。

Fig.1 Effect of TWP on pathological changes of kidneys of DN rats(HE ×400).See Tab.1 for the rat treatments.A:normal group;B:model group，the arrows show glomerular hypertrophy，mesangial cell proliferation and glomerular deformation.C，D and E:TWP 4.5，9 and 18 mg·kg－1group，respectively，the arrows show significant improvement in renal pathological changes.

3 討論

本研究結(jié)果表明，用TWP 8周后大鼠毛色明顯轉(zhuǎn)好，體質(zhì)量增加，自發(fā)活動(dòng)亦明顯改善，精神、進(jìn)食量和飲水量明顯改善，BUN和24 h UAER顯著降低，Clcr明顯升高，表明TWP對(duì)DN大鼠腎有保護(hù)作用。

研究認(rèn)為，2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及其病程程度與自由基引發(fā)和介導(dǎo)的機(jī)體氧化損傷及機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)清除自由基能力平衡失調(diào)密切相關(guān)［3－4］。正常狀態(tài)下，腎有完整的抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)，機(jī)體內(nèi)自由基、過(guò)氧化脂質(zhì)和抗氧化酶之間保持著動(dòng)態(tài)平衡。糖尿病時(shí)以腎組織中糖代謝紊亂為主的多種因素造成腎組織中包括過(guò)氧化氫、和羥自由基(OH－)在內(nèi)的反應(yīng)性氧化產(chǎn)物過(guò)多［5］。MDA是機(jī)體內(nèi)活性氧攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用，進(jìn)而形成的過(guò)氧化物，其含量的多少可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而間接反映細(xì)胞損傷的程度［6］。本研究表明，TWP可降低損傷脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA水平和血清中含量。GSH-Px缺乏或耗竭GSH-Px會(huì)使許多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素毒性作用加重，這與氧化損傷具有很大的相關(guān)性［7］。CAT也是體內(nèi)重要的自由基清除劑，可分解H2O2。本研究證實(shí)，TWP可降低損傷脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA水平，增加腎組織中GSH-Px與CAT的活性。DN大鼠腎組織病理變化表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管呈不規(guī)則增厚，腎小球毛細(xì)血管腔變狹窄，腎小球肥大、系膜細(xì)胞增生、基底膜增厚及突出融合等。本研究結(jié)果表明，TWP可減輕DN大鼠腎組織病理變化，劑量較高時(shí)，組織病理變化的改善越明顯。

綜上所述，TWP對(duì)DN大鼠腎具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其降低MDA和含量、升高GSH-Px和CAT活性、抑制氧化應(yīng)激并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

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