蝙蝠蛾擬青霉菌絲體抗小鼠力竭疲勞作用

許宇輝，梁慧春，楊 征

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所認(rèn)知與心理衛(wèi)生研究中心，北京 100850)

疲勞是一種普遍的生理現(xiàn)象，主要包括精神疲勞和軀體疲勞兩種，在我國因過度疲勞致病甚至死亡的人數(shù)逐年增加，全球調(diào)查顯示，35%以上的人群處于疲勞狀態(tài)［1］。疲勞不僅伴隨著各種疾病的發(fā)生如艾滋病、肝炎及腫瘤等［2－3］，而且也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，內(nèi)分泌失調(diào)，從而引起多種疾病，如感染、糖尿病等［1，4］。自 1880 年 Mosso 開始研究人類疲勞至今，大量研究者對(duì)疲勞進(jìn)行了探討，并對(duì)疲勞發(fā)生的機(jī)制提出了各種假說，如能量耗竭學(xué)說，代謝產(chǎn)物累積學(xué)說以及中樞遞質(zhì)失衡學(xué)說等［5］。在疲勞的研究中，我國具有豐富的中藥資源與基礎(chǔ)，很多中藥已被廣泛用于改善疲勞，并顯示出優(yōu)越的抗疲勞作用［6］。

蟲草是我國稀有的傳統(tǒng)藥材，目前已發(fā)現(xiàn)的蟲草種類至少有400多種［7］，而其中的冬蟲夏草〔Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc〕特指產(chǎn)于青海、西藏及云南地區(qū)的蟲草，其蟲體為蝙蝠蛾科的蟲草蝙蝠蛾幼蟲。研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草具有抗腫瘤、抗衰老、耐缺氧和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種藥理學(xué)活性［8－9］。在抗疲勞領(lǐng)域的研究中，大量的研究結(jié)果也顯示了冬蟲夏草及其提取物具有改善人體運(yùn)動(dòng)耐力，緩解機(jī)體疲勞，延長嚙齒類動(dòng)物強(qiáng)迫游泳時(shí)間等多種抗疲勞作用［10－13］。

然而，由于野生冬蟲夏草通常只能生長在3500～5000 m的青藏等地區(qū)，且必須寄生于蝙蝠蛾科的蟲草蝙蝠蛾幼蟲中才能生存，人們對(duì)其藥用價(jià)值的研究與運(yùn)用也受到了限制，近年來由于野生冬蟲夏草資源的過度開采，使其成為瀕危物種［14］。為解決這些問題，越來越多的研究者開始致力于冬蟲夏草及其人工替代品的研發(fā)。1982年，中國中醫(yī)研究院中藥研究所在云南迪慶藏族自治州采集到新鮮冬蟲夏草，并從中分離出10多種真菌菌株，其蟲體經(jīng)鑒定并確認(rèn)為蝙蝠蛾科的蟲草蝙蝠蛾。1989年，戴如琴等［15］對(duì)其中的4個(gè)菌株進(jìn)行了培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察，并將其命名為蝙蝠蛾擬青霉［15］。隨著發(fā)酵培育技術(shù)的發(fā)展與運(yùn)用，冬蟲夏草中提取的蝙蝠蛾擬青霉菌株可通過人工發(fā)酵培育的方式進(jìn)行大規(guī)模的無性繁殖與生產(chǎn)。由此獲得的蝙蝠蛾擬青霉菌絲體(Paecilomyces hepiali mycelium，PHM)已被成功開發(fā)為滋補(bǔ)、保健的功能性食品或藥物，如國內(nèi)已上市的“金水寶膠囊”和國外已上市的“Cordy-MaxTM”。大量的研究表明，人工發(fā)酵培育的PHM具有與野生冬蟲夏草相似的成分及藥理學(xué)活性［16－19］。本研究的目的是采用輪式疲勞儀建立小鼠力竭疲勞模型，并通過檢測疲勞相關(guān)的能源物質(zhì)與代謝產(chǎn)物來評(píng)價(jià)人工培育的PHM對(duì)小鼠力竭疲勞的作用，并探討其潛在的作用機(jī)制。

莫達(dá)非尼是一種中樞興奮性藥物，于1994年在法國上市，主要用于抗疲勞，調(diào)節(jié)睡眠，改善認(rèn)知以及維持高危操作人員清醒狀態(tài)［20－22］。研究發(fā)現(xiàn)，該藥能夠激動(dòng)腦內(nèi) α1腎上腺素受體［23－24］，并抑制多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體，增加大腦皮質(zhì)和尾狀核多巴胺濃度［25－27］，其抗疲勞作用與調(diào)節(jié)中樞的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。本研究選用莫達(dá)非尼作為陽性對(duì)照藥物，以檢測實(shí)驗(yàn)中所建立的力竭疲勞模型，并對(duì)比評(píng)價(jià)PHM的抗力竭疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

人工發(fā)酵培育的PHM干燥粉末(蘭州科林生物醫(yī)藥有限公司，腺苷含量為0.74 mg·g－1)溶于滅菌注射用水中，配制成濃度為14，28和56 g·L－1的混懸溶液供小鼠ig給藥。莫達(dá)非尼(山東齊魯制藥，生產(chǎn)批號(hào):110619-1，純度99.57%)溶于1%的CMC-Na 中，配制成濃度為 1.3 g·L－1的混懸溶液供小鼠 ig給藥用。給藥體積均為每 0.1 mL(10 g)。科研用試劑盒，包括糖原試劑盒、血清尿素氮試劑盒、乳酸試劑盒以及血清肌酸激酶試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

YLS-10B型8通道小鼠輪式疲勞儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，中國)，每個(gè)輪式跑道的寬為5 cm，直徑為20 cm。UV-1200型紫外分光光度儀(上海美譜達(dá)儀器有限公司，中國)。D2012小型高速離心機(jī)(Scilogex，美國)。

1.2 動(dòng)物、模型制備［24］與分組

72只雄性昆明小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(軍)2012-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～22℃，濕度為50% ～60%。動(dòng)物自由攝食、飲水，并保持12 h的黑暗交替。飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為正常對(duì)照組，模型組，莫達(dá)非尼13 mg·kg－1組，PHM 140，280 和560 mg·kg－1組。除正常對(duì)照組外，其余小鼠采用輪式疲勞儀使小鼠接受每日30 min且連續(xù)18 d的強(qiáng)迫攀跑訓(xùn)練，第1 天(d 1)攀跑速度為 10.2 m·min－1，并在隨后的d 5，d 9，d 13和d 17分別將速度增加至10.8，11.4，12.0 和12.6 m·min－1;d 19 小鼠進(jìn)行速度為12.6 m·min－1，時(shí)間為60 min的力竭訓(xùn)練。除正常對(duì)照組小鼠僅給予溶媒而不參與攀跑訓(xùn)練外，其他所有小鼠均于給藥后40 min進(jìn)行強(qiáng)迫攀跑訓(xùn)練。

1.3 電擊次數(shù)及體質(zhì)量的測定

1.2項(xiàng)處理的各組小鼠，分別于d5，d9，d13，d17和d19記錄小鼠在訓(xùn)練中所受的電擊次數(shù)，并記錄小鼠每天的體質(zhì)量。

1.4 組織樣本的準(zhǔn)備與生化指標(biāo)的檢測

在d19力竭訓(xùn)練結(jié)束后，將小鼠置于安靜環(huán)境中休息40 min，休息過程中自由攝食、飲水。休息結(jié)束后，通過眼眶取血，并立即經(jīng)頸椎脫斷處死小鼠，在冰板上迅速取出動(dòng)物的肝和后肢肌肉組織，用冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后凍存于－20℃冰箱內(nèi)。血液樣品于45°斜面靜置30 min后，以4000×g離心 15 min，取上清液，凍存于－20℃冰箱內(nèi)。按照試劑盒要求檢測以上組織樣品中肌糖原，肝糖原，血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PHM對(duì)力竭小鼠體質(zhì)量的影響

表1結(jié)果顯示，未參與攀跑訓(xùn)練的正常對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量略高于其他組動(dòng)物，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給予PHM和莫達(dá)非尼組的體質(zhì)量與模型組相比，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明PHM和莫達(dá)非尼對(duì)小鼠的體質(zhì)量無影響。

2.2 PHM對(duì)力竭小鼠電擊次數(shù)的影響

表2結(jié)果顯示，與模型組相比，莫達(dá)非尼組小鼠在首次給藥后便能明顯降低小鼠的電擊次數(shù)，且d9，d13和d17所記錄的電擊次數(shù)仍顯著低于模型組(P ＜0.01)。PHM 280和560 mg·kg－1組在連續(xù)給藥17 d后，其電擊次數(shù)才開始顯著低于模型組(P＜0.01)。在d19的力竭訓(xùn)練中，莫達(dá)非尼組和PHM 280和560 mg·kg－1組的電擊次數(shù)顯著下降(P ＜0.01)。此外，PHM 140 mg·kg－1雖然在一定程度上減少了小鼠的電擊次數(shù)，但與模型組相比并無顯著性差異。

Tab.1 Effect of Paecilomyces hepiali mycelium(PHM)on body mass of exhausted mice

2.3 PHM對(duì)小鼠肌糖原、肝糖原、血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶水平的影響

表3結(jié)果顯示，與未參與攀跑訓(xùn)練的正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的肌糖原和肝糖原水平顯著降低(P＜0.01)，而血清尿素氮和血清肌酸激酶水平則顯著升高(P＜0.05)，說明小鼠在接受長期高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，其體內(nèi)能源供給不足，代謝產(chǎn)物累積過度。然而，這種致疲勞的改變可以通過連續(xù)使用PHM而得到改善或恢復(fù)，尤其是PHM 560 mg·kg－1不僅能有效升高由高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致低水平的肌糖原和肝糖原(P＜0.01)，還能顯著降低由高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致高水平的血清尿素氮，血清乳酸和血清肌酸激酶(P＜0.05)。陽性對(duì)照藥物為莫達(dá)非尼對(duì)于長期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致的疲勞相關(guān)能源物質(zhì)含量的下降及代謝產(chǎn)物的累積并無明顯的改善作用。

Tab.2 Effect of PHM on number of electric shocks of exhausted mice

Tab.3 Effect of PHM on fatigue-related biochemical parameters of exhausted mice

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PHM連續(xù)給藥17 d后能夠顯著降低小鼠的電擊次數(shù)，并能顯著增加小鼠體內(nèi)肌糖原和肝糖原水平，降低致疲勞代謝產(chǎn)物血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶的水平。PHM抗疲勞機(jī)制與莫達(dá)非尼并不相同，PHM可能通過增加機(jī)體糖原的儲(chǔ)備，增強(qiáng)有氧代謝，并減少運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)致疲勞代謝產(chǎn)物的積累而起到抗疲勞的作用。

一直以來，許多研究中均采用強(qiáng)迫游泳模型來進(jìn)行力竭疲勞實(shí)驗(yàn)，但存在易致動(dòng)物嗆水，造成動(dòng)物恐懼等缺點(diǎn)。目前，一些研究也開始關(guān)注并利用嚙齒類動(dòng)物善于攀跑的特性，通過采用輪式疲勞儀來強(qiáng)迫動(dòng)物接受長期的攀跑訓(xùn)練，以此來模擬動(dòng)物的力竭疲勞［28－29］。與強(qiáng)迫游泳模型相比，輪式疲勞儀能夠避免人為計(jì)時(shí)誤差、動(dòng)物嗆水、恐懼等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的干擾，同時(shí)實(shí)驗(yàn)人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況來調(diào)整和設(shè)置動(dòng)物攀跑訓(xùn)練的各種條件和參數(shù)，如運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度以及運(yùn)動(dòng)時(shí)間等。在訓(xùn)練過程中，儀器通過電擊來強(qiáng)迫小鼠進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)并自動(dòng)記錄動(dòng)物的被電擊次數(shù)，從而更客觀地反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力與疲勞的發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，陽性對(duì)照藥莫達(dá)非尼在首次給藥后便能顯著減少動(dòng)物的電擊次數(shù)，增強(qiáng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力，但其對(duì)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致體內(nèi)肌糖原，肝糖原，血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶改變并無影響，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似［24，30］。許多研究顯示，莫達(dá)非尼能夠激動(dòng)腦內(nèi) α1腎上腺素受體［23－24］，抑制多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體，增加大腦皮質(zhì)和尾狀核多巴胺濃度［25－27］的作用，并能增加動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)。因此，其抗疲勞作用可能與調(diào)節(jié)中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。PHM首次給藥并不能馬上起效，但其在連續(xù)給藥17 d后開始顯示出抗疲勞作用，在顯著降低小鼠電擊次數(shù)的同時(shí)，還能顯著增加小鼠體內(nèi)肌糖原和肝糖原含量，并降低血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶水平。此外，文獻(xiàn)報(bào)道顯示，PHM 具有鎮(zhèn)靜、催眠作用［31］，由此說明，PHM抗力竭疲勞的機(jī)制與莫達(dá)非尼不同，與調(diào)節(jié)中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平無關(guān)。

目前對(duì)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的形成機(jī)制有多種理論學(xué)說，如“能源耗竭理論”，“代謝產(chǎn)物累積理論”及“內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失衡理論”等［5，32］。這些理論學(xué)說認(rèn)為，疲勞是由機(jī)體運(yùn)動(dòng)后能源物質(zhì)儲(chǔ)備下降，致疲勞的代謝產(chǎn)物累積以及由此引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡等多種因素引起［5，32－33］。研究表明，運(yùn)動(dòng)所致的體能耗竭總是與糖原的耗竭同時(shí)發(fā)生。當(dāng)機(jī)體進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌糖原可迅速被動(dòng)用，從而為肌肉的收縮提供能量，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，肌糖原逐漸耗竭。此時(shí)，為維持正常的血糖水平，機(jī)體開始動(dòng)用肝糖原，進(jìn)而導(dǎo)致肝糖原減少［34］。糖原的耗竭將會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，尤其是運(yùn)動(dòng)耐力。因此，體內(nèi)肌糖原和肝糖原的含量是反映軀體運(yùn)動(dòng)耐力和疲勞發(fā)生快慢或程度的敏感指標(biāo)［35－37］。通常情況下，糖原等物質(zhì)的有氧代謝是機(jī)體的主要供能方式，1 mol葡萄糖可凈生成32或34 mol ATP。但是在長時(shí)間、高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)中，機(jī)體處于相對(duì)缺氧的狀態(tài)，由于有氧代謝的速度較慢，無法及時(shí)滿足能量需要，因此機(jī)體通過無氧糖酵解方式迅速生成ATP供能。然而，1 mol葡萄糖經(jīng)糖酵解方式只能凈生成2 mol ATP，其供能效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有氧代謝，不僅增加了糖原消耗的速度和程度，同時(shí)還導(dǎo)致機(jī)體生成大量的乳酸。研究表明，乳酸作為無氧糖酵解的產(chǎn)物會(huì)引起骨骼肌細(xì)胞內(nèi)H+和無機(jī)磷(Pi)的堆積，從而抑制橫橋活性和肌漿網(wǎng)中Ca2+釋放，并降低肌纖維對(duì)Ca2+的敏感性，最終使肌細(xì)胞收縮功能下降而出現(xiàn)疲勞［38－41］。因此，乳酸水平也是反映機(jī)體有氧代謝能力和疲勞程度的重要指標(biāo)。此外當(dāng)糖原代謝所提供的能量無法滿足機(jī)體運(yùn)動(dòng)所需的能量時(shí)，機(jī)體會(huì)動(dòng)員脂肪的分解，甚至蛋白質(zhì)的分解來提供能量，從而使蛋白代謝產(chǎn)物血清尿素氮的含量升高，因而通過檢測機(jī)體血清尿素氮的含量也可以反映出機(jī)體的運(yùn)動(dòng)供能和代謝情況，從而間接提示機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力與疲勞程度［42］。當(dāng)機(jī)體功能不足時(shí)，體內(nèi)血清肌酸肌酶能夠代償性的增加，從而促進(jìn)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)換為肌酸，并進(jìn)一步促使肌酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰姿峒∷岱肿樱宰鳛榧?xì)胞快速獲取能量的來源。但是，血清肌酸肌酶含量的增加會(huì)對(duì)肌肉造成物理或化學(xué)形式的損傷，從而降低機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力，加重機(jī)體的疲勞狀況［43－44］。因此，體內(nèi)血清肌酸激酶含量的升高可以反映出機(jī)體供能不足和運(yùn)動(dòng)能力下降。

綜上，PHM可能通過增加能源物質(zhì)的儲(chǔ)備，增強(qiáng)機(jī)體有氧代謝能力，并減少機(jī)體致疲勞代謝產(chǎn)物的積累，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及正常代謝功能，從而起到抗力竭疲勞的作用。PHM作為冬蟲夏草替代品用于緩解疲勞可能具有一定的潛力和良好的前景。

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