蚊蟲兩種靶標抗性機制的研究進展*

趙明惠 李春曉 趙彤言**

(1. 安徽醫(yī)科大學，合肥 230032；2.軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071)

蚊蟲是重要的媒介昆蟲之一，是傳播多種疾病的重要媒介，包括登革熱、瘧疾、絲蟲病、流行性乙型腦炎、西尼羅病毒病等(馬淮健等，2000；崔峰和喬傳令，2007；吳治明等，2013；朱小娟等，2013)，由于其特殊的生理行為而與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)。目前對于蚊蟲的綜合防治措施仍以化學防治為主，有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑自上個世紀中葉被開發(fā)合成以來，由于其具有合成簡單、殺蟲譜廣等優(yōu)點，而被廣泛的應用于蚊蟲的防治中。80年代初，擬除蟲菊酯類殺蟲劑因為具有高效、低毒和對環(huán)境友好等特點也被人們大量的使用。但是由于這些殺蟲劑的長期、大量應用，已經(jīng)導致蚊蟲抗藥性的持續(xù)發(fā)生(徐菲等，1999；王士珍等，2000；曾林海等，2008；張家林等，2008；李士根等，2010)。不僅抗性蚊蟲種類在逐年增多，而且抗性倍數(shù)也在不斷增加，并出現(xiàn)多重抗性現(xiàn)象，蚊蟲抗性的產(chǎn)生和抗性的加強成為蚊蟲防治中的突出問題。

對蚊蟲抗性的研究已經(jīng)逐步從生理生化水平發(fā)展到分子水平，例如蚊蟲的靶標抗性就是其對化學殺蟲劑抗性的分子機制之一。靶標是殺蟲劑對蚊蟲產(chǎn)生致死效應的靶部位，如有機磷和氨基甲酸酯類抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)，DDT和擬除蟲菊酯抑制鈉離子通道，環(huán)戊二烯類抑制γ-氨基丁酸受體及保幼激素受體等。各類殺蟲劑通過以上多種途徑對蚊蟲產(chǎn)生毒性或致死效應(胡小邦和朱昌亮，2004；亢春雨等，2007)。靶標抗性是指由于殺蟲劑作用靶標敏感度降低而產(chǎn)生的抗藥性，從而降低殺蟲劑的毒性效應，進而起不到殺蟲效果。由于靶標抗性的產(chǎn)生可導致昆蟲對一類殺蟲劑甚至對同時有交叉抗性的另一類殺蟲劑也產(chǎn)生抗藥性，從而嚴重制約了殺蟲劑的持續(xù)使用，因此靶標抗性在抗藥性機理的研究中也就顯得更為重要。在對蚊蟲的靶標抗性機制研究中，鈉離子通道和乙酰膽堿酯酶靶標抗性的研究最為深入，本文將從分子水平對這兩種靶標抗性的作用機制研究進展進行簡單的介紹。

1 鈉離子通道

1.1 鈉離子通道的結(jié)構(gòu)

鈉通道由3個亞基組成，包括一個主要的α亞基和兩個較小的β輔助亞基。α亞基形成離子的滲透洞孔，兩個β亞基在調(diào)節(jié)通道功能中起著關(guān)鍵的作用。鈉通道α亞基蛋白由1 800～2 500個氨基酸組成，它們的共同結(jié)構(gòu)的特征如圖1所示，含4個大的同源結(jié)構(gòu)域(Ⅰ～Ⅳ)，每個結(jié)構(gòu)域有6個疏水性跨膜螺旋體(S1～S6)，以及一個S5～S6之間的保守序列元件，后者形成離子孔道。肽鏈的N端和C端都在膜的細胞質(zhì)一側(cè)。N端位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ的前面，由110個氨基酸組成。C端位于結(jié)構(gòu)域Ⅳ的后面，由315個氨基酸組成。糖基化位點位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅲ的膜外部分(唐振華等，2004)。

圖1 鈉離子通道結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the sodium channel (from Hille et al., 1999)

鈉通道蛋白如同鉀通道和鈣通道一樣，存在許多的通道蛋白亞型。對哺乳動物鈉通道蛋白的研究表明不同的蛋白亞型具有不同的生理功能和藥理學特性(Goldin，2001)。研究表明哺乳動物中鈉通道蛋白多樣性是不同基因選擇性表達的結(jié)果。然而對昆蟲鈉通道的研究表明，Pre-mRNA的選擇性剪接是產(chǎn)生昆蟲鈉離子通道蛋白多樣性的主要原因，選擇性剪接所產(chǎn)生的不同鈉通道蛋白亞型也受時間和空間的影響(Thackerayetal.，1995)。迄今為止，昆蟲鈉通道基因的選擇性剪接已在多種果蠅和蚊蟲中發(fā)現(xiàn)，包括黑尾果蠅Drosophilamelanogaster(Loughneyetal.，1989)、家蠅Muscadomestica(Leeetal.，2002)、尖音庫蚊Culexpipiens(Martinez-Torresetal.，1999)、致倦庫蚊Cx.quinquefasciatus(Heetal.，2012)等。

1.2 鈉離子通道與蚊蟲抗性的關(guān)系

鈉離子通道是擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標，此類殺蟲劑通過控制鈉通道的失活而使昆蟲出現(xiàn)興奮狀態(tài)或中毒癥狀。昆蟲通過鈉通道基因的突變對該類殺蟲劑產(chǎn)生抗性，稱為擊倒抗性(kdr，knockdown resistance)。擊倒抗性最初是在對DDT具有抗性的意大利品系家蠅中首次被描述(Busvine，1951)，Milani(1956)將該抗性表型命名為擊倒抗性，在此之后發(fā)現(xiàn)在包括多種蚊蟲在內(nèi)的昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了這樣的突變。鈉離子通道功能位點的突變使其蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生巨大的變化，對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的敏感性降低。對家蠅的Vssc1鈉通道定向突變進行研究，使其含有L1014F突變，然后與果蠅tipE蛋白在爪蟾卵母細胞中表達，成為“Vssc1/tipE”通道，并用2個電極的電壓鉗進行測定含有L1014F突變的Vssc1/tipE通道和不含L1014F突變的野生型通道對各種擬除蟲菊酯的敏感性和尾電流衰退速率，結(jié)果表明突變導致其對生物芐呋菊酯的敏感性降低了10倍，并且導致尾電流加速衰退(Smithetal.,1997)。此外，對黑腹果蠅，德國小蠊和煙蚜夜蛾的研究也表明，含有L1014F突變的鈉通道的對不同類型的擬除蟲菊酯的敏感性都會明顯地下降。并且在大多數(shù)情況下會伴隨加速尾電流衰退的速率(Vaisetal., 2000；Zhaoetal., 2000;Tanetal., 2002a)。

1.3 蚊蟲鈉離子通道與抗性相關(guān)的基因突變

圖2 岡比亞按蚊kdr基因型的系統(tǒng)進化關(guān)系Fig. 2 TCS network showing the genealogical relations among kdr haplotypes of Ae. gambiae(from Pinto et al.，2007)

與擬除蟲菊酯抗性有關(guān)的鈉通道氨基酸序列多態(tài)性突變有很多報道。研究發(fā)現(xiàn)，蚊蟲鈉通道ⅡS6節(jié)段L1014位點是一個較保守的突變位點，經(jīng)典突變類型L1014F(TTA-TTT)普遍見于岡比亞按蚊(Martinez-Torresetal.,1998)、淡色庫蚊(Songetal.,2007)、致倦庫蚊(Xuetal.,2011)等蚊蟲。這些突變的出現(xiàn)，使得蚊蟲對殺蟲劑的敏感性降低，進而產(chǎn)生對其的抗藥性。在蚊科昆蟲中也相繼發(fā)現(xiàn)了幾個出現(xiàn)在這一位點的雙突變，如岡比亞按蚊、斯氏按蚊、薩氏按蚊、尖音庫蚊和淡色庫蚊的L1014F(TTA-TTT)和L1014S(TTA-TCA)雙突變(Martinez-Torresetal.,1999； Luleyapetal.,2002；Etangetal.,2006；Chenetal.,2010；Singhetal.,2011； Wangetal.,2012)，致倦庫蚊的L1014F(TTA-TTT)和(TTA-TTC)的堿基雙突變(Wondjietal.,2008)，中華按蚊的L1014F(TTG-TTT)和L1014C(TTG-TGT)雙突變與高效氯氰菊酯抗性密切相關(guān)(Kimetal.,2007;Tanetal.,2012)。此外，在其他位點也發(fā)現(xiàn)許多突變與抗性密切相關(guān)，例如，埃及伊蚊的I1011M和V1016G突變(Brenguesetal.,2003)及同一位點的I1011V和V1016I突變與長時間的接觸氯菊酯有關(guān)(Saavedra-Rodriguezetal.,2007)、V1016G和D1763Y雙突變(Changetal.,2009)、V1016G和S989P雙突變與溴氰菊酯的抗性有關(guān)(Srisawatetal.,2010)、F1269C突變與90%的丙烯除蟲菊酯關(guān)系密切(Kawadaetal.,2009)；白紋伊蚊的F1534C突變與氯菊酯抗性有關(guān)(Kasaietal.,2011)；庫態(tài)按蚊的V1010L和L1014S雙突變(Singhetal.,2010)；岡比亞按蚊的N1575Y突變補償了L1014F突變對DDT和氯菊酯抗性的適合度代價(Jonesetal.,2012)；中華按蚊的N1013S 和L1014W突變(Tanetal.,2012b)等都與殺蟲劑的使用密切相關(guān)。對某一蚊蟲而言，既可能是某一位點的單突變，也可能是雙突變或聯(lián)合突變。不同種類的蚊蟲鈉通道基因突變的類型不完全相同，即在一定程度上具有種的特異性。對一些重要媒介蚊蟲需要有針對性的研究，以揭示其特定的突變類型。

目前，與抗性相關(guān)的鈉離子通道基因突變在世界各地多個國家的多種蚊蟲中都有發(fā)現(xiàn)，包括拉丁美洲的埃及伊蚊(Saavedra-Rodriguezetal.,2007)，非洲的岡比亞按蚊(Jonesetal.,2012)，朝鮮的中華按蚊(Kimetal.,2007)，新加坡的白紋伊蚊(Kasaietal.,2011)，湄公河流域的的迷走按蚊，中華按蚊和帶足按蚊(Verhaeghenetal.,2010)，泰國、墨西哥和巴西的埃及伊蚊(Brenguesetal.,2003；Garciaetal.,2009；Srisawatetal.,2010)，印度的庫態(tài)按蚊(Singhetal.,2010)，肯尼亞的岡比亞按蚊，阿拉伯按蚊和催命按蚊(Kawadaetal.,2011)，以及我國的淡色庫蚊、中華按蚊(Tanetal.,2012a；Wangetal.,2012)等蚊蟲。這些抗性突變的產(chǎn)生與擬除蟲菊酯類殺蟲劑的使用密切相關(guān)，在今后的衛(wèi)生城市創(chuàng)建中，要注意這類殺蟲劑的使用，加強抗性監(jiān)測。

1.4 蚊蟲鈉離子通道基因突變的進化

對非洲15個國家的岡比亞按蚊kdr基因的研究表明，鈉離子通道基因突變至少經(jīng)歷了4次獨立的變化(圖2)(Pintoetal.，2007)。前兩次是比較明確的單核苷酸變異導致的基因突變，包括H1-1014F和H1-1014S，它們分別是通過T1105A和T11O4C兩個核苷酸突變形成的；后兩次變異則認識的相對模糊,只是一些假設認為這兩次變異(H2-1014S和H3-1014F)分別來自攜帶kdr基因突變的前體，即H1-1014S和H1-1014F，在此基礎上各自再經(jīng)歷了一次突變而形成的。另有猜測表示后兩次突變是來自突變型和野生型kdr基因的重組(Hudsonetal., 1985)。無論突變的來源是什么，這都與殺蟲劑的選擇壓力和基因流密切相關(guān)。

2 乙酰膽堿酯酶

2.1 乙酰膽堿酯酶的晶體結(jié)構(gòu)與功能位點

2.1.1乙酰膽堿酯酶的晶體結(jié)構(gòu): Sussman等(1991)首次報道了電鰩Torpedocalifornica的AChE催化亞基晶體X射線衍射圖譜。實驗結(jié)果顯示，該催化亞基是由14個α螺旋與12個β折疊組成，α螺旋和β折疊在晶體中的含量分別為15%、30%。亞基大小為4.5 nm×6.0 nm×6.5 nm，呈橢球狀，β折疊位于橢球狀分子的中央，α螺旋將其包圍。AChE的晶體形式是糖酯錨型的同源二聚體，在羧基端的半胱氨酸(Cys537)形成二硫鍵(施明安等，2000)。

2.1.2乙酰膽堿酯酶的功能位點：乙酰膽堿酯酶的主要功能位點有7個，分別是催化三聯(lián)體，膽堿結(jié)合位點、酰基口袋、養(yǎng)陰離子洞、外圍陰離子位點，芳香族氨基酸谷內(nèi)表面以及后門，它們在催化底物反應過程中分別起著不同的作用。催化三聯(lián)體包括Ser200、Glu327、His440三個氨基酸，位于谷內(nèi)，稱活性部位谷(Aactive site gorge)，屬于氫鍵型，使Ser200變得更為親核，攻擊乙酰膽堿的碳，導致形成乙?；?，并迅速去乙?；?。膽堿結(jié)合位包括Trp84、Tyr330、Tyr442和Glu199四個氨基酸，構(gòu)成與底物的結(jié)合部位。酰基口袋包括Phe288、Phe290兩個氨基酸，在谷內(nèi)壁一側(cè)，它們的側(cè)鏈伸向活性中心，約束活性空問范圍，從而限制較大的底物和環(huán)基進入活性中心。氧陰離子洞包括Gly118、G1y119和Ala201三個氨基酸，它們由主鏈氮原子與羰基氧相互作用，以及酯鍵的氧與His440的咪唑基相互作用共同構(gòu)成。外圍陰離子位點由Tyr70、Tyr71、Trp279和Asp72四個氨基酸組成，它們位于AChE分子外表面近谷的入口處，都帶負電荷，有助于提高AChE的催化效力。芳香族氨基酸形成谷內(nèi)表面，它們由14個疏水性的氨基酸殘基組成，它們是5個Tyr：Tyr70、Tyr121、Tyr130、Tyr334、Tyr442；5個Trp：Trp80、Trpl14、Trp233、Trp279和Trp432和4個Phe：Phe288、Phe 290、Phe330和Phe331。它們占谷內(nèi)表面氨基酸殘基的40%。其主要功能足加速底物向活性中心擴散，把乙酰膽堿吸收到低親和力位點，接著通過二維擴散至活性部位，使酶具有很高的催化活力。后門由Cys67、Cys95之間的“Q”嚕噗組成，促使催化反應過程中形成有序地通道開放，后門的開放供產(chǎn)物釋放(唐振華等，2002)。

2.2 乙酰膽堿酯酶與蚊蟲抗性的關(guān)系

乙酰膽堿酯酶作為一種絲氨酸水解酶，通過催化神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)傳遞物質(zhì)(乙酰膽堿)的水解而終止神經(jīng)沖動。有機磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑就是以乙酰膽堿酯酶為靶標，通過酶活性位點的絲氨酸羥基磷酸化和?；豢赡娴匾种泼傅幕钚?，使乙酰膽堿的分解受阻，導致在神經(jīng)突觸和高度興奮的中樞神經(jīng)體統(tǒng)中乙酰膽堿濃度的積聚，使突觸后神經(jīng)持續(xù)沖動，神經(jīng)系統(tǒng)的敏感性降低，最終導致生物體的死亡。AChE基因的突變使乙酰膽堿酯酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變活性中心的空間結(jié)構(gòu)，從而導致AChE對有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸鹽類農(nóng)藥敏感性下降(Muteroetal.,1994；Zhuetal.,1996；Walshetal.,2001；Vontasetal.,2002)。Radic等(1992)以電鰩的AChE為模型，用天冬氨酸和谷氨酸胺替代AChE的谷氨酸199后發(fā)現(xiàn)AChE與膽堿酯酶抑制劑的親和力降低了，并且該酶的磷酸化率和氨基甲酸酯化率降低。這一結(jié)果表明昆蟲AChE谷氨酸199的突變將導致昆蟲對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑抗性的產(chǎn)生。Vaughan等(1997)以桿狀病毒為載體，通過PCR定位誘變導入敏感cDNA，經(jīng)過重組的桿狀病毒含有野生突變型和7個突變的Ace cDNA位點(3個單基因突變：F105S，G285A，F(xiàn)350Y；3個雙突變：F105S+G285A，F(xiàn)350Y+F1O5S，F(xiàn)35OY+G285A；一個三聯(lián)突變: F105A+G285A+F350Y)。Sf21細胞在細胞指數(shù)生長的后期被重組的桿狀病毒大量轉(zhuǎn)染，并表達誘變的AChE，然后測量活性。研究結(jié)果表明，對于有機磷殺蟲劑paraxon，有4種基因突變(F105S+G285A，G285A+F350Y，G285A和F105S+G285A+F350Y)與野生型AChE相比有相當高的IC50，其中低者(Fl05S+G285A)可提高15倍，而高者(G285A+F350Y)則可提高至120倍。而對于氨基甲酸酯殺蟲劑卡巴呋喃來說，有3種基因突變在反應中輕度提高了IC50，其中Fl05S+F350Y提高了5倍，F(xiàn)l05S+G285A+F35OY提高了8倍，G285A+F35OY提高了12倍。同樣的突變也導致對另一種氨基甲酸酯殺蟲劑殘殺威IC50值的提高，如F105S+F350Y提高30倍，G285A+F350Y提高60倍，F(xiàn)l05S+G285A+F350Y則可提高至80倍。突變型AChE與野生型AChE ki值之比顯示出在不同的突變結(jié)構(gòu)中AChE的不敏感性的水平，總的趨勢是與抗性相關(guān)的突變位點越多，AChE殘余活性越高，抗性比就越高，說明蚊對殺蟲劑的不敏感性水平是由不同的結(jié)構(gòu)基因突變造成的。以上證據(jù)表明基因突變導致的氨基酸替代可能影響酶活性部位的空間構(gòu)象，這種變化也改變了殺蟲劑對酶活性部位的抑制作用，從而產(chǎn)生抗性。所以，Ace基因突變是導致蚊對殺蟲劑產(chǎn)生抗性的一個重要原因，不敏感的AChE是蚊蟲對有機磷酸酯類和氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的普遍機制(Fournieretal.,1994)。

2.3 蚊蟲中發(fā)現(xiàn)的與抗性相關(guān)的乙酰膽堿酯酶基因突變

乙酰膽堿酯酶是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標。在一些抗性品系蚊蟲的乙酰膽堿酯酶分子中發(fā)現(xiàn)單氨基酸替換現(xiàn)象，這些突變使乙酰膽堿酯酶對殺蟲劑不敏感程度上升，從而產(chǎn)生抗藥性。蚊蟲有2個AChE，即AChE1和AChE2，分別由ace-1和ace-2編碼，研究顯示只有ace-1與抗藥性有關(guān)(Bourguetetal.,1996；王敦等，2006)。到目前為止，在蚊蟲中只發(fā)現(xiàn)3個單氨基酸置換與抗性有關(guān)。包括G119S(GGC-AGC)突變、F331W(TTT-TGG)突變和F290V(TTT-GTT)突變。Weill等(2003)發(fā)現(xiàn)尖音庫蚊和岡比亞按蚊中的G119S突變與有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的抗性密切相關(guān)。Liu (2005)等發(fā)現(xiàn)致倦庫蚊中存在的G119S突變與毒死蜱抗性有關(guān)。Nabeshima等(2004)在日本三帶喙庫蚊的Ace1基因中發(fā)現(xiàn)一個突變F455W，相當于在Torpedo中F331，并證明與高水平的有機磷抗性有關(guān)；Alout等(2007b)發(fā)現(xiàn)塞浦路斯尖音庫蚊中存在的F290V突變與有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑密切相關(guān)。在對中國不同地區(qū)雜鱗庫蚊的G119S突變和三帶喙庫蚊的F331W突變與有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑抗性進行研究時發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性密切。

目前，在具有基因變異的乙酰膽堿酯酶在世界上許多國家的蚊蟲中都有發(fā)現(xiàn)，包括法國的尖音庫蚊和岡比亞按蚊(Weilletal. 2003)，塞浦路斯，黎巴嫩和突尼斯的尖音庫蚊(Aloutetal. 2007；Benetal. 2009；Ostaetal. 2012)，貝寧和非洲西部的致倦庫蚊(Chandreetal. 1997；Djogbénouetal. 2008),以及我國的雜鱗庫蚊，三帶喙庫蚊和尖音庫蚊(Cuietal. 2006；Aloutetal. 2007a)等。但是突變只發(fā)現(xiàn)在少數(shù)幾種蚊蟲中，這也許與乙酰膽堿酯酶基因突變產(chǎn)生的適合度代價較大有關(guān)系(Berticatetal. 2008；Djogbénouetal. 2010)。

2.4 蚊蟲乙酰膽堿酯酶基因突變的進化

蚊蟲乙酰膽堿酯酶基因的突變遵循“改善基因”的基本原則。在70年代最初使用有機磷類殺蟲劑的時候，蚊蟲通過基因的突變(G119S)來適應強大的殺蟲劑選擇壓力，雖然這一突變事件在沒有使用殺蟲劑的區(qū)域?qū)蚴怯卸竞ψ饔玫模瞧淙匀辉趶V泛的傳播。之后這一基因型經(jīng)歷了兩次獨立的復制。第一次是敏感和抗性的ace基因之間通過復制而結(jié)合，在這一時期，抗性的ace基因并沒有完全被替代，因為形成的純合子由于尚不致死。第二次復制形成的雜合子毒害效應也不致命，所以也開始流傳。乙酰膽堿酯酶基因抗性相關(guān)的突變是核苷酸突變，殺蟲劑選擇和基因重排的結(jié)果(Lynchetal.，2000；Labbeetal.，2007)。

綜上所述，蚊蟲在長期的化學殺蟲劑的選擇壓力下，已從分子水平上進化出抵抗這種選擇壓的能力，因此對其抗藥性分子機理的研究具有重要的理論及現(xiàn)實意義。隨著分子生物學的發(fā)展，基因芯片技術(shù)的普及和后基因組時代的到來，人們對蚊蟲抗性形成和進化的研究從分子水平展開了比較深入的研究，對抗性蚊蟲的基因進行了分離、克隆和差異表達的鑒定，為進一步研究每種抗性機制的整條通路奠定了基礎。系統(tǒng)回答蚊蟲的抗性生理問題的分子機制是目前抗藥性領(lǐng)域的研究趨勢，這將使人們對于蚊蟲抗性產(chǎn)生和發(fā)展的認識更加深刻，在實際生產(chǎn)生活中對殺蟲劑的使用也起到重要的指導作用。