兔球蟲PCR檢測方法的改進和應用*

汪運舟 陶鴿如 崔玉娟 李 超 王 丹 焦雅清索 勛 劉賢勇

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

兔艾美耳球蟲是一類專性寄生于兔消化系統(tǒng)的寄生原蟲，能夠引起嚴重的兔球蟲病。當前兔球蟲共有11個有效種，各個種之間致病性存在較大的差異，對兔群的危害程度也不盡相同。因此有效的蟲種鑒別，對評估球蟲病暴發(fā)的風險有著十分重要的意義。

傳統(tǒng)兔球蟲的檢測方法主要是利用飽和食鹽水漂浮觀察糞便中球蟲卵囊，根據形態(tài)學差異進行蟲種區(qū)分(Pakandl, 2009)；隨著PCR技術的應用，對蟲種間高度特異的靶基因進行檢測，可以更加靈敏準確地鑒定球蟲種類。Oliveira等(2011)利用11種兔球蟲ITS序列設計特異性引物，從而建立了能夠區(qū)分11個兔球蟲種的PCR檢測方法；Yan等(2013)建立了兔球蟲多重PCR檢測技術，可以對多個高致病性蟲種進行鑒定。但是PCR檢測需要一定量的卵囊制備DNA模板，當樣品中卵囊含量較少時，制備的基因組含量不易達到PCR檢測的閾值，使其應用受到了限制。因此提高檢測的靈敏度，克服卵囊數量少的阻礙，對于該技術在田間檢測中更廣泛的應用有著重要意義(Barbaraetal., 2008)。

當前全基因組擴增技術(Whole genome amplification，WGA)能夠對微量樣品中的DNA進行隨機擴增，擴大初始模板，提高PCR的靈敏度和檢測的成功率(Hawkinsetal., 2002)。基于該技術，我們建立了兔球蟲單卵囊PCR技術，能夠在單個卵囊的水平上進行蟲種鑒定，從而大大提高PCR反應的靈敏度(Wangetal., 2014)。因此，將該技術應用于田間樣品的檢測有著較大的可行性。

本研究對田間樣品卵囊裂解過程進行優(yōu)化，引入WGA技術處理制備后的基因組模板，以提高后續(xù)PCR反應的靈敏度，最后通過對田間樣品的檢測，驗證優(yōu)化后的方法在田間樣品檢測中的可應用性。

1 材料與方法

1.1 卵囊樣品

用于驗證裂解方法的卵囊：實驗室保存的斯氏艾美耳球蟲Eimeriastiedai張家口分離株。田間樣品為實驗室保存的采集自河北省多家新西蘭白兔養(yǎng)殖場的兔糞樣品。

1.2 卵囊裂解液

取10% 的SDS溶液溶液，用無菌去離子水倍比稀釋，使終濃度分別為0.01%、0.1%和1%，作為卵囊裂解液；蛋白酶K(10 mg/mL)購自德國默克公司。

1.3 單卵囊的分離與裂解

取斯氏艾美耳球蟲卵囊，利用倍比稀釋法稀釋至約1～2個/μL。將卵囊懸液滴至0.5 cm×0.5 cm的透析膜上，用鑷子將帶有卵囊的透析膜移入含有5 μL卵囊裂解液(0.01%、0.1%或1%SDS)的PCR管中；將PCR管置于液氮中反復凍融5次，之后加入0.5 μL蛋白酶K(20 mmol/L)，55℃孵育2 h，95℃孵育30 min以滅活蛋白酶K。同時驗證化學裂解和不同方法單獨處理后的裂解效果，不同裂解程序見表1，通過對裂解處理樣品進行PCR檢測，確定最佳裂解方法。

1.4 田間樣品的純化

本研究所用的田間樣品中卵囊含量較低，低于或接近麥克馬斯特計數法的檢測閾值(每毫升不足100個卵囊)，因此須先用飽和鹽水濃集法對卵囊進行富集。取田間糞便樣品混液1 mL，3 600 r/min離心5 min，棄去上清；沉淀中加入飽和食鹽水，重懸，3 600 r/min離心5 min，用移液器吸取含卵囊的上清移至另一離心管中；加入約5倍體積的無菌雙蒸水，3 600 r/min離心5 min，棄去上清；沉淀即為樣品中卵囊。沉淀用5 μL卵囊裂解液(SDS)重懸后進行裂解處理，方法見1.3。樣品卵囊用于PCR檢測前進行形態(tài)學觀察。

1.5 全基因組擴增

卵囊裂解產物進行全基因組擴增。向卵囊裂解產物中加10×Phi29 DNA 聚合酶緩沖液1 μL，隨機引物(100 μmol/L)2.5 μL，95℃加熱3 min，立即置于冰上冰浴15 min；加入0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，0.5 μL 100 ×BSA，0.5 μL Phi 29 DNA聚合酶(10 U/μL，NEB公司)，30℃溫育過夜；過夜產物65℃溫育10 min，使Phi 29 DNA聚合酶失活；取1 μL 上述全基因擴增產物作為模板進行PCR反應。

1.6 ITS-1序列的擴增

兔球蟲屬特異性和種特異性ITS-1序列引物根據Oliveira(2011)報道進行合成。實驗前將所有11對引物序列與NCBI已知各蟲種ITS-1序列進行比對，確定各對特異性引物僅能與特定序列結合，而不能與其他蟲種ITS-1序列結合，具有良好的特異性。選用巢式PCR進行檢測，首先將全基因組擴增產物取1 μL作為模版，利用兔球蟲屬特異性引物進行PCR擴增，再以第一輪PCR擴增產物1 μL作為模板進行種特異性引物擴增。兩輪PCR擴增體系與程序相同，擴增體系為：上下游特異性引物各0.5 μL(25 μmol/L)，2×Taq Mix 12.5 μL(CwBio)，ddH2O 10.5 μL，模板1 μL；反應體系為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共計25個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，特異性條帶回收后測序，結果與NCBI已報道的兔球蟲ITS-1序列進行比對。

2 結果

2.1 兔球蟲PCR檢測方法的優(yōu)化

根據表1的不同方法，我們對單個斯氏艾美耳球蟲卵囊進行了裂解，裂解產物進行WGA擴增后用于PCR檢測。結果顯示結合液氮凍融、0.01% SDS和蛋白酶K消化的方法能夠有效裂解卵囊釋放基因組，處理后的產物能夠成功進行PCR擴增(圖1)；而使用其他方法，則因為裂解不充分或者有抑制PCR成分而擴增效果不佳(表1)。利用優(yōu)化后的裂解方法，我們對10個斯氏艾美耳球蟲單個卵囊進行了擴增，PCR后均獲得相應大小的條帶，測序結果顯示擴增成功(圖2)。結果表明利用優(yōu)化后的裂解方法，結合WGA技術對卵囊模板進行預擴增能夠保證基因組模板的含量，可在單個卵囊的水平上進行蟲種鑒定，體現了較高的靈敏度。

2.2 田間樣品的PCR檢測

對10份田間樣品，我們首先進行了鏡檢，通過形態(tài)學特征對其中的卵囊種類進行判斷。之后利用優(yōu)化后的方法，進行PCR檢測。結果顯示10份樣品的PCR擴增均獲成功，圖3為其中一份卵囊樣品的PCR檢測結果。各蟲種特異性引物所對應泳道中出現的條帶大小其對應大小相吻合；我們選取11份代表各蟲種的PCR產物進行測序，測序結果表明各種特異性引物所對應的產物序列，均為其所對應的蟲種，序列比對后相似性均大于97%，證明PCR方法成功鑒定了樣品中所含蟲種。10份樣品的成功檢測表明了優(yōu)化后的PCR檢測方法能夠用于田間卵囊含量較少的樣品檢測。

表 1 不同裂解方法以及效果Tab. 1 The comparison of the effect with different lysis methods

注：++ 代表成功擴增，+代表部分能夠擴增，— 代表擴增失敗。

Note: ++ represents fully successful amplification, + represents partially successful amplification, — represents negative amplification.

圖1 不同裂解方法裂解后斯氏艾美耳球蟲PCR檢測結果Fig.1 PCR detection results of E. stiedai with single oocyst after different lysis methods1～6: 不同裂解方法(表1)裂解后獲得DNA進行PCR反應的電泳結果; 7: 為陰性對照; M：DNA marker D2000 plus。1-6: Individual PCR product after different lysis methods (Tab. 1); 7: Negative control; M：DNA marker D2000 plus.

圖2 斯氏艾美耳球蟲單卵囊PCR檢測結果Fig. 2 Single oocyst PCR detection results of E. stiedaiwith single oocyst1～10: 10個斯氏艾美耳球蟲單卵囊PCR擴增產物; 11: 陽性對照；M：DNA marker D2000 plus；12 ：陰性對照。1-10: Ten single oocyst PCP product of E. stiedai individually；11: Positive control; M: DNA marker D2000 plus; 12: Negative control.

2.3 形態(tài)學觀察與PCR檢測結果比較

對形態(tài)學鑒定結果與PCR檢測結果進行比較。結果顯示，樣品中形態(tài)學鑒定出的蟲種都可以應用PCR方法檢測確認，符合率100%(表2)；其中有6份田間樣品中含有大量未孢子化的卵囊，因此無法從外殘體、卵膜孔的特征等方面進行具體的蟲種鑒定，因此依據PCR鑒定的方法對其蟲種進行了判定。總體來看，對于樣品中形態(tài)特征明顯的蟲種檢測呈現了良好的一致性，對于不易判斷的蟲種，PCR檢測給予更為可靠的檢測結果。

表2 田間樣品形態(tài)學與PCR檢測結果對比Tab. 2 Comparison between morphological and PCR identification

E.mag：大型艾美耳球蟲；E.med：中型艾美耳球蟲；E.int：腸艾美耳球蟲；E.vej：維氏艾美耳球蟲；E.sti：斯氏艾美耳球蟲；E.per：穿孔艾美耳球蟲；E.coe：盲腸艾美耳球蟲；E.irr：無殘艾美耳球蟲；E.pir：梨形艾美耳球蟲；E.exig：小型艾美耳球蟲；E.fla：黃艾美耳球蟲?！?”：有；—：無；“/”前為PCR鑒定結果，后為形態(tài)學鑒定結果。

PCR identification showed before the mark‘/’, while morphological identification after ‘/’;‘+’: positive; ‘—’: negative.

圖3 田間樣品的PCR檢測結果Fig. 3 PCR detection results of ten field samples1：大型艾美耳球蟲；2：維氏艾美耳球蟲；3：腸艾美耳球蟲；4：穿孔艾美耳球蟲；5：中型艾美耳球蟲；6：斯氏艾美耳球蟲；7：盲腸艾美耳球蟲；8：無殘艾美耳球蟲；9：梨形艾美耳球蟲；10：小型艾美耳球蟲；11：黃艾美耳球蟲；M：DNA marker D2000 plus。1: E. magna; 2: E. vejdovskyi; 3: E. intestinalis; 4: E. perforans; 5: E. media; 6: E. stiedai; 7: E. coecicola; 8: E. irresidua; 9: E. piriformis; 10: E. exigua; 11: E. flavescens; M: DNA Marker D 2000 plus.

3 討論

兔球蟲的蟲種有11個之多，進行準確的蟲種鑒定對于流行病學調查以及蟲株純度檢驗有著十分重要的意義。本研究對PCR檢測方法進行了改進，通過優(yōu)化卵囊的裂解方法和引入WGA技術，提高PCR檢測的靈敏度，并以此成功地對卵囊含量較少的田間樣品進行檢測。

田間樣品采集及鑒定常遇到待檢微生物含量較少、基因組提取過程中有所損失的問題，導致達不到PCR的檢測閾值而呈假陰性結果(Lynnetal., 2009)。因此本研究將常見的裂解方法進行組合，探索適于檢測的田間樣品的PCR模板快速制備方法。該體系中，液氮凍融和蛋白酶K(需滅活)的使用不會引入PCR反應的抑制成分，是很好的裂解手段，但是由于單獨使用不能夠完全裂解卵囊，所以需要引入其他的輔助方法；而SDS作為一種陰離子去污劑，能夠破壞蛋白質的分子結構，而被廣泛的利用于蛋白質的裂解，但是SDS的存在會影響PCR反應的進行(Wilson, 1997)，因此需要控制其使用濃度。試驗中我們通過比較試驗，表明了SDS的適用濃度為0.01%，能夠有效裂解卵囊且不抑制PCR反應的進行。利用上述裂解方法，能夠將DNA的獲取和后續(xù)反應在同一PCR管中進行，減少了模板在不同反應空間內的轉移次數，進行有效避免了模板的損失。

田間樣品中卵囊含量少時難于提供足夠的檢測模板用于PCR反應，因此很多樣品的檢驗只能使用眼觀鏡檢的方法來確定，使蟲種鑒定的準確性大大降低。因此有必要對田間樣品進行有效的處理，以達到PCR反應的閾值，利用全基因組擴增技術正是克服模板含量低的有效方法(Deanetal., 2002)。我們已成功的將WGA技術應用于兔球蟲基因組的擴增，能夠在單個卵囊的水平上對ITS-1這一蟲種鑒定的重要序列進行PCR擴增(Wangetal., 2014)。因此我們將WGA技術引入到田間蟲種鑒定中來。利用該方法，鑒定出了眼觀并未確認的蟲種，證明了起在田間樣品檢測中應用的可行性。因此該方法較傳統(tǒng)先提取基因組再進行PCR檢測方法，更為靈敏；且準確性較形態(tài)學觀察的方法大大提高。

綜上所述，我們通過探索卵囊的裂解方法和引入WGA技術，提高了PCR檢測手段在兔球蟲田間樣品檢測中的靈敏度，擴大了其應用范圍，能夠成為有效的田間蟲種檢測手段。