應(yīng)用線粒體基因序列分析虎的進(jìn)化關(guān)系

石俊松，田存鋒，許繼國，張秀娟，李 莉，張守全

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

虎屬于哺乳綱、食肉目、貓科、豹屬、虎種，一般虎被分為8個(gè)亞種，現(xiàn)僅存5個(gè)亞種.在這僅存的5個(gè)亞種中，華南虎 Panthera tigris amoyensis、東北虎P.tigris altaica和孟加拉虎P.tigris tigris也瀕臨滅絕，尤其是華南虎.為了成功地保護(hù)物種，除了要保護(hù)其棲息地和最大限度地增加種群數(shù)量外，還必須保護(hù)其遺傳多樣性.遺傳多樣性貧乏的物種，在環(huán)境中將十分脆弱，因而其進(jìn)化前景暗淡［1］.

為了制定有效的繁殖對(duì)策，以最大限度地保存圈養(yǎng)虎群體的遺傳多樣性，必須首先弄清起源群體的遺傳結(jié)構(gòu)，這是任一圈養(yǎng)動(dòng)物繁殖中迫切需要解決的問題.由于虎類是一個(gè)比較年輕的類群，亞種間基因進(jìn)化較保守，單一基因的信息量尚不足以解決該類群的系統(tǒng)發(fā)育問題，增加新的DNA序列的研究是解決問題的關(guān)鍵之一.同時(shí)，采用多基因序列數(shù)據(jù)也是由基因樹到物種樹的必然要求.近年來，人們開始注意線粒體DNA(mtDNA)在系統(tǒng)進(jìn)化研究中的作用，同時(shí)人們已經(jīng)把它們用于貓科動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化研究［2-3］.哺乳動(dòng)物的線粒體DNA是雙鏈環(huán)狀DNA，能夠獨(dú)立復(fù)制，不與組蛋白結(jié)合，另外，線粒體DNA所具有的線粒體基因組復(fù)制與表達(dá)所需的多種酶則由核基因編碼，因此，線粒體是一個(gè)半自主性細(xì)胞器［4］.White等［5］研究發(fā)現(xiàn)線粒體 DNA 沒有內(nèi)含子，缺乏有效的基因修復(fù)系統(tǒng)，極易發(fā)生突變，與核DNA相比，mtDNA具有母系遺傳、拷貝數(shù)多、突變率高和極少發(fā)生重組等特性，是研究分子生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化和群體遺傳學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵工具;其中mtDNA高突變率和極少發(fā)生重組的特性，使得較短時(shí)間內(nèi)積累的變異可以連續(xù)而忠實(shí)地遺傳下去，通過分析這些變異的分布范圍與頻率等信息，從而可以更好地研究種群關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化.

鄭濤［6］利用中國產(chǎn)13種貓科動(dòng)物的12SrRNA基因(約371 bp)和Cytb部分序列(約355 bp)進(jìn)行了分析，其構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示了云豹、豹、雪豹和虎具有較近的親緣關(guān)系，支持將它們同歸于豹屬的觀點(diǎn).Luo等［3］對(duì)134份虎樣本的4 kb mtDNA序列進(jìn)行了分析，提出現(xiàn)存的虎有6個(gè)亞種:東北虎、北印支虎、華南虎、馬來虎、蘇門答臘虎和孟加拉虎.張文平等［7］利用線粒體DNA的D-loop區(qū)及ND5部分序列構(gòu)建了東北虎、孟加拉虎和華南虎的系統(tǒng)進(jìn)化樹.韋鹍［8］利用mtDNA的ND5基因研究了華南虎的遺傳多樣性.本文主要利用mtDNA COⅠ基因、COⅢ基因和ND4基因部分序列來構(gòu)建東北虎、孟加拉虎和華南虎的系統(tǒng)進(jìn)化樹，探討3種虎的進(jìn)化關(guān)系，也為虎的物種樹的建立提供一些依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料來源和mtDNA提取

本試驗(yàn)采集了廣西熊虎山莊東北虎和孟加拉虎的血液樣品，每種取3～4個(gè)個(gè)體，其中東北虎個(gè)體編號(hào)為Pta01、Pta02、Pta03和Pta04，孟加拉虎編號(hào)為Ptt01、Ptt02、Ptt03和Ptt04.將虎麻醉后從尾部靜脈采全血10 mL，按 V(血液)∶V(ACD 抗凝劑)=6∶1的比例混勻抗凝，于－80℃條件保存?zhèn)溆?華南虎肌肉組織樣來自廣州動(dòng)物園自然死亡的1頭華南虎，編號(hào)為Pts01.

線粒體DNA的提取結(jié)合了DNA總基因組和質(zhì)粒DNA的提取方法，并對(duì)常規(guī)酚－氯仿抽提法改進(jìn).所得的mtDNA溶于TE緩沖液中，－20℃條件保存?zhèn)溆?

1.2 PCR 擴(kuò)增

根據(jù)從NCBI GenBank上搜索得到的家貓F(tuán)elis catus(NC_001700)、獵豹 Acinonyx jubatus(NC_005212，)、云豹 Neofelis nebulosa(NC_008450) 的mtDNA全序列，利用DNAssist 1.0比對(duì)，選取序列的保守區(qū)，利用Primer permier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由Oligo檢驗(yàn)，最后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.COⅠ引物序列為:F-GCTCGAACCTCTGTCTTTAG，R-CCAAAACCGGGTAGGATTAA;COⅢ引物序列為:F-GCCTATGTTTTTACCCTGCT，R-CTACGTCTACGAAGTGTCAA;ND4引物序列為:F-GGCAATCAAACAGAGCG，R-GGAAGTTAGTCCGTGGG.

PCR擴(kuò)增條件:25 μL反應(yīng)體系含50 ng基因組模板，1 × PCR 緩沖液，8 μmol/L 引物，200 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，1 U Taq DNA 聚合酶.94 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸50 s，72℃后延伸5 min，4℃條件下保存產(chǎn)物.

1.3 產(chǎn)物的回收和測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，由DNA膠回收試劑盒(上海生工)回收純化，并與 pMD18-T載體(TaKaRa公司)連接，然后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)藍(lán)白篩選，送陽性克隆的菌液到上海英駿生物科技有限公司測序.

1.4 序列分析及構(gòu)建進(jìn)化樹

所有測得的序列比對(duì)(Sequence alignment)使用DNAStar軟件包的 EditSeq、SeqMan、Megalign 等軟件進(jìn)行編輯，并進(jìn)行人工校對(duì)，以確保序列的準(zhǔn)確性.然后用DNAssit分析各物種間各個(gè)序列間的差異，單倍型多樣度.用DNAStar等計(jì)算序列的堿基組成及序列間的轉(zhuǎn)換/顛換值、遺傳距離，并計(jì)算序列的堿基組成百分率等.

選擇家貓、獵豹及云豹的mtDNA作為外群，利用Mega 4.0采用鄰接法(Neighbour-joining，NJ)重建華南虎、東北虎、孟加拉虎的進(jìn)化關(guān)系樹，系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的自助置信水平(Bootstrap confidence level，BCL)應(yīng)用自引導(dǎo)估計(jì)，共1000次循環(huán).

2 結(jié)果

2.1 華南虎、孟加拉虎和東北虎的mtDNA序列

通過測序，共得到25個(gè)序列，其中COⅠ基因8個(gè)個(gè)體(東北虎3個(gè)、孟加拉虎4個(gè)、華南虎1個(gè))各755 bp(NCBI GenBank登錄號(hào):FJ422123，F(xiàn)J422145，F(xiàn)J455122，F(xiàn)J455124，F(xiàn)J455125，F(xiàn)J461529 ～461531);COⅢ基因8個(gè)個(gè)體(東北虎4個(gè)、孟加拉虎4個(gè))各742 bp，華南虎1個(gè)個(gè)體737 bp(NCBI GenBank登錄號(hào):FJ461532 ～461534，F(xiàn)J465508 ～465511，F(xiàn)J469625);ND4基因8個(gè)個(gè)體(東北虎3個(gè)、孟加拉虎4個(gè)、華南虎1個(gè))各561 bp(NCBI GenBank登錄號(hào):FJ608583～608585，F(xiàn)J694968 ～694972).

2.2 序列差異及分析

2.2.1 COⅠ基因 通過DNAssist軟件對(duì)這些序列的優(yōu)化及比對(duì)，發(fā)現(xiàn)3只東北虎中出現(xiàn)3種線粒體COⅠ單倍型，共有2個(gè)變異位點(diǎn);4只孟加拉虎出現(xiàn)2種線粒體COⅠ單倍型，只有1個(gè)變異位點(diǎn).

由序列比對(duì)可知，8個(gè)個(gè)體的序列共檢測到多態(tài)位點(diǎn)13個(gè)，占分析位點(diǎn)總數(shù)(750 bp)的1.73%，2核苷酸間的變異位點(diǎn)13個(gè)，無3核苷酸間的變異位點(diǎn).因此，3個(gè)虎亞種的mtDNA COⅠ基因序列變異主要有轉(zhuǎn)換和顛換2種類型，無轉(zhuǎn)換與顛換共存的現(xiàn)象.東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的序列兩兩堿基替換情況和遺傳距離列于表1.

表1 東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的COⅠ序列間的轉(zhuǎn)換/顛換(上三角)和遺傳距離(下三角)Tab.1 Numbers of transition/transversion(upper-right matrix)and genetic distances(Kimura 2-parameter model，lowerleft matrix)for COⅠsequences of Siberian tiger，Bengal tiger，South China tiger and clouded leopard

從表1中可以看出:虎亞種間的Kimura 2-parameter遺傳距離范圍為0.0013～0.0148，變異程度較大，亞種之間距離最小的為東北虎和孟加拉虎，最大的為東北虎同華南虎;東北虎個(gè)體之間的遺傳距離和孟加拉虎個(gè)體之間遺傳距離均小于亞種之間的遺傳距離.云豹和虎亞種之間的距離范圍是0.1492～0.1615，其中和華南虎最小，和東北虎最大.

2.2.2 COⅢ基因 對(duì)4個(gè)東北虎個(gè)體、1個(gè)華南虎個(gè)體和4個(gè)孟加拉虎個(gè)體的mtDNA進(jìn)行了克隆測序，得到了這9個(gè)個(gè)體各737 bp的序列.通過DNAssist軟件對(duì)這些序列的優(yōu)化及比對(duì)，發(fā)現(xiàn)4只東北虎中只有1種線粒體COⅢ基因單倍型，4只孟加拉虎也只有1種線粒體COⅢ基因單倍型.可見在虎中線粒體COⅢ基因個(gè)體差異極小.

由序列比對(duì)可知，9個(gè)個(gè)體的序列共檢測到多態(tài)位點(diǎn)4個(gè)，約占分析位點(diǎn)總數(shù)(737 bp)的0.54%，2核苷酸間的變異位點(diǎn)4個(gè)，無3核苷酸間的變異位點(diǎn).因此，3個(gè)虎亞種的mtDNA COⅢ基因序列變異主要有轉(zhuǎn)換和顛換2種類型，無插入/缺失和轉(zhuǎn)換與顛換共存的現(xiàn)象.東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的序列兩兩堿基替換情況和遺傳距離列于表2.

從表2中可以看出:虎亞種間的Kimura 2-parameter遺傳距離范圍為0.0000～0.0055，變異程度較大，遺傳距離最大為東北虎和華南虎，而東北虎和孟加拉虎、華南虎和孟加拉虎之間的遺傳距離是一樣的(D=0.0027).東北虎個(gè)體之間、孟加拉虎個(gè)體之間遺傳距離均為0.云豹和虎亞種之間的遺傳距離范圍是0.1181～0.1249，變異程度較小，其中和華南虎遺傳距離最小，和東北虎遺傳距離最大.

表2 東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的COⅢ序列間的轉(zhuǎn)換/顛換(上三角)和遺傳距離(下三角)Tab.2 Numbers of transition/transversion(upper-right matrix)and genetic distances(Kimura 2-parameter model，lowerleft matrix)for COⅢsequences of Siberian tiger，Bengal tiger，South China tiger and clouded leopard

2.2.3 ND4基因 對(duì)3個(gè)東北虎個(gè)體、1個(gè)華南虎個(gè)體和4個(gè)孟加拉虎個(gè)體的mtDNA進(jìn)行了克隆測序，得到了這8個(gè)個(gè)體各561 bp的序列.通過DNAssist軟件對(duì)這些序列的優(yōu)化及比對(duì)，發(fā)現(xiàn)3只東北虎只有1種線粒體ND4單倍型;4只孟加拉虎有2種線粒體ND4單倍型，總共有1個(gè)變異位點(diǎn).

由序列比對(duì)可知，8個(gè)個(gè)體的序列共檢測到多態(tài)位點(diǎn)3個(gè)，約占分析位點(diǎn)總數(shù)(561 bp)的0.53%，2核苷酸間的變異位點(diǎn)3個(gè)，無3核苷酸間的變異位點(diǎn).因此，3個(gè)虎亞種的mtDNA ND4區(qū)序列變異主要有轉(zhuǎn)換和顛換2種類型，無缺失/插入、轉(zhuǎn)換與顛換共存的現(xiàn)象.東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的序列兩兩堿基替換情況和遺傳距離列于表3.

表3 東北虎、孟加拉虎、華南虎和云豹的ND4序列間的轉(zhuǎn)換/顛換(上三角)和遺傳距離(下三角)Tab.3 Numbers of transition/transversion(upper-right matrix)and genetic distances(Kimura 2-parameter model，lowerleft matrix)for ND4 sequences of Siberian tiger，Bengal tiger，South China tiger and clouded leopard

從表3可看出:虎亞種間的Kimura 2-parameter遺傳距離范圍為0.0000～0.0054，變異程度較小;華南虎和孟加拉虎2個(gè)個(gè)體的遺傳距離最大，和其他個(gè)體的遺傳距離一樣;而東北虎個(gè)體之間的遺傳距離為0.云豹和虎亞種之間的遺傳距離范圍是0.1442～0.1466，變異程度較小，其中和孟加拉虎2個(gè)個(gè)體最大，和其他個(gè)體的遺傳距離一樣.

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用Mega 4.0軟件，基于Kimura兩參數(shù)距離采用鄰接法(NJ法)來構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以云豹作為外群比較，同時(shí)引進(jìn)家貓和獵豹的同區(qū)域序列作對(duì)照.從圖1～3中可以看出該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分為3個(gè)支系，東北虎同孟加拉虎聚在一起，自助置信水平為99%;然后再與華南虎的支系聚合.

圖1 基于COⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic trees with the Kimura-2 parameter model based on the COⅠgene

圖2 基于COⅢ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic trees with the Kimura-2 parameter model based on the COⅢgene

圖3 基于ND4基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic trees with the Kimura-2 parameter model based on the ND4 gene

3 討論

3.1 3個(gè)基因的保守性及在進(jìn)化關(guān)系中的應(yīng)用

在基因序列方面，3個(gè)基因序列呈現(xiàn)較多的一致性.3個(gè)基因序列都富含A、T，而G的含量都是最少的.張方等［9］認(rèn)為脊椎動(dòng)物線粒體基因組遺傳密碼的使用存在偏倚性，密碼子的第3位堿基為A和C的比例明顯高于G和T，其中A的比例最高，G最低.

從種內(nèi)的單倍體個(gè)數(shù)來看，3個(gè)基因單倍體個(gè)數(shù)都較少，呈現(xiàn)保守性，且種間多態(tài)性位點(diǎn)也較少，在位點(diǎn)的突變中也全部是轉(zhuǎn)換和顛換，而且以轉(zhuǎn)換為主，多為無義突變.衡量一個(gè)群體mtDNA的遺傳多樣性的指標(biāo)有2個(gè):單倍型多樣度和核苷酸多樣度.這2個(gè)指標(biāo)的值越大，群體的多樣性程度越高，遺傳多樣性越豐富，反之群體的多樣性程度越低，遺傳多樣性越貧乏.因此一方面說明這3個(gè)基因比較保守，另一方面也說明3種虎的遺傳多樣性較低.

從遺傳距離上看，不論個(gè)體還是亞種間，3個(gè)基因呈現(xiàn)的遺傳距離均較低，亞種間最高的為COⅠ基因，其最高遺傳距離才為 0.0148.Nei［10］認(rèn)為地理種群之間的遺傳距離在0.00～0.05，亞種間的遺傳距離約為0.05或更大.然而有許多例外，在有些情況下，亞種間的遺傳距離可能與地理種群間的遺傳距離一樣小.由于亞種分類可能受到人為因素的影響，在分類學(xué)實(shí)踐中亞種形態(tài)分化的標(biāo)準(zhǔn)以約75%的個(gè)體呈現(xiàn)不同為界限;另一方面，形態(tài)學(xué)變化和分子歧異之間既存在相關(guān)性，又存在獨(dú)立性［11］，在分子水平研究亞種的親緣關(guān)系時(shí)，得到的遺傳距離可能會(huì)大于或小于 Nei［10］估算的亞種間的遺傳距離.例如，Ball等［12］對(duì)紅翅黑鸝 Agelaius phoeniceus的研究和Carr等［13］對(duì)維基尼亞鹿 Odocoileus virginianus的研究都表明種群間mtDNA差異程度較小，最大的分別為 0.008 和 0.016.Ashley 等［14］對(duì)黑犀牛 Diceros bicormis 2亞種的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，2亞種之間的遺傳距離僅為0.0029.吳平等［15］利用 RFLP和PCR-RFLP技術(shù)研究東北虎和華南虎線粒體DNA多態(tài)性，結(jié)果顯示東北虎和華南虎的遺傳距離只有0.00135.

3.2 從3個(gè)基因的序列片段構(gòu)建的進(jìn)化樹看虎的進(jìn)化關(guān)系

本研究結(jié)果可以看出華南虎和東北虎、孟加拉虎的遺傳距離要大于東北虎和孟加拉虎之間的遺傳距離，而以云豹為外群構(gòu)建的進(jìn)化樹中也可以看出，3個(gè)基因序列片段構(gòu)建的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相近，均是東北虎和孟加拉虎先合為一枝，然后與華南虎匯合;且相同的亞種都聚在各自的樹枝上，個(gè)體間的遺傳差異較小，內(nèi)群的平均遺傳距離均小于外群的遺傳距離，所以能夠很好地區(qū)分和3個(gè)亞種間的關(guān)系.Kimball等［16］研究表明，置信度大于70%的進(jìn)化枝是比較可信的，而本文構(gòu)建的基因樹除基于COⅢ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹有1支為64%外，其余均大于70%，因此構(gòu)建的基因樹是可信的.從COⅠ、COⅢ和ND4基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹我們可以得出東北虎和孟加拉虎均是由華南虎進(jìn)化而來的結(jié)論.而譚邦杰［17］從地理位置上、張文平［1］從線粒體 DNA D-loop區(qū)和ND5基因構(gòu)建的進(jìn)化樹也均說明了3種虎的進(jìn)化由來，鑒于現(xiàn)存華南虎的數(shù)量及華南虎在虎進(jìn)化史上的地位，需要我們?cè)谌A南虎的保護(hù)上作出更多的努力.

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