高遷移率族蛋白B1對大鼠局灶腦缺血/再灌注后大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)神經(jīng)干細胞增殖的影響*

李 滿， 羅 勇， 李 圓， 孫 麟

腦缺血/再灌注損傷后，腦內(nèi)會出現(xiàn)神經(jīng)干細胞的自發(fā)增殖。既往研究證實，神經(jīng)干細胞的自發(fā)增殖可發(fā)生在海馬齒狀回顆粒細胞下層、側(cè)腦室室管膜下區(qū)和大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)，并于7～10 d達增殖的高峰［1-3］。然而腦缺血/再灌注損傷后誘導神經(jīng)干細胞自發(fā)增殖的內(nèi)在原因一直未能明確。已知腦缺血/再灌注損傷可刺激星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化并釋放炎癥因子高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)參與后期的炎癥反應［4］。但近期研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后HMGB1的釋放有利于血管內(nèi)皮細胞的增殖，并促進血管再生［5］。在斑馬魚腦發(fā)育的過程中，HMGB1可促進神經(jīng)前體細胞的增殖和前腦的形成［6］，而在腦出血后，HMGB1可以促進血腫周圍神經(jīng)干細胞的增殖和血管再生［7］。那么腦缺血/再灌注后HMGB1在受損局部的釋放是否也參與了促進腦缺血后神經(jīng)干細胞自發(fā)增殖，目前尚未見相關報道。本研究通過制作大鼠局灶腦缺血/再灌注模型，應用RNA干擾技術抑制腦內(nèi)HMGB1蛋白表達，采用5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromo-2′-deoxyuridine，BrdU)體內(nèi)標記的方法，檢測神經(jīng)干細胞增殖高峰期再灌注7 d時大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)BrdU和神經(jīng)巢蛋白(nestin)雙標記陽性細胞，判斷局灶腦缺血/再灌注損傷后HMGB1蛋白表達是否有促進大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)神經(jīng)干細胞增殖的作用。

材料和方法

1 動物與分組

清潔級成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重250～300 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2012-0001。將大鼠隨機分為假手術組、局灶腦缺血/再灌注模型組(模型組)、局灶腦缺血/再灌注+HMGB1 shRNA干擾組(RNA干擾組)和局灶腦缺血/再灌注+陰性對照shRNA干擾組(陰性干擾組)，每組12只。

2 主要試劑

BrdU購自 Sigma;兔抗大鼠 HMGB1購自 Abcam;小鼠抗大鼠膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)購自CST;兔抗大鼠巢蛋白(nestin)購自武漢三鷹生物技術有限公司;小鼠抗BrdU購自Abcam;山羊抗小鼠Alexa Flour 647Ⅱ抗購自碧云天生物制劑公司;山羊抗兔TRITCⅡ抗、β-actin和辣根過氧化物酶標記的抗兔/鼠Ⅱ抗均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;攜帶HMGB1 shRNA和陰性對照shRNA的慢病毒載體由上海吉凱基因股份有限公司合成;Western blotting相關試劑購自碧云天生物制劑公司。

3 主要方法

3.1 大鼠局灶腦缺血/再灌注模型的制備 根據(jù)Longa等［8］的經(jīng)驗，采用改良線栓法制備右側(cè)大腦中動脈局灶腦缺血/再灌注模型。大鼠經(jīng)3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.1 mL/kg)后，仰臥位固定于操作臺上，備皮、消毒;經(jīng)頸部正中切口依次暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈顱外段;斷離頸內(nèi)、外動脈分支及交通支，距頸外動脈分叉約0.5 cm處灼燒斷離頸外動脈，在殘端做一環(huán)形切口;取一長35 mm、直徑為0.23 mm的尼龍釣絲，在一端約5 mm長度上均勻涂一層聚氨酯，使其直徑達0.25～0.26 mm左右，晾干后備用;將線栓由頸外動脈經(jīng)切口向頸內(nèi)動脈顱內(nèi)方向插入17～20 mm，遇阻力表明線栓頭端已通過大腦中動脈起始部，實現(xiàn)右側(cè)大腦中動脈缺血;清理手術野，全層縫合皮膚。缺血1 h后拔回線栓至頸外動脈殘端，實現(xiàn)再灌注。假手術組僅將線栓插入頸內(nèi)動脈而不栓塞大腦中動脈。大鼠清醒后行神經(jīng)功能學評分，參照Longa 5分制評分標準，評分2～3分的大鼠為造模成功，被用于實驗。術中出血較多、出現(xiàn)呼吸困難、取腦時發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血及提前死亡者剔除，并補足相應只數(shù)。

3.2 慢病毒介導的腦內(nèi)RNA干擾 攜帶HMGB1 shRNA的慢病毒序列如下:5′-GATCCCGAAGCACCCGGATGCTTCTTTCAAGAGAAGAAGCATCCGGGTGCTTCTTTTTTGGAAA-3′［3］。陰性對照 shRNA 序列對目前已知的mRNA無任何干擾作用(序列由上海吉凱基因股份有限公司提供)。再灌注2 d后，分別將RNA干擾組和陰性干擾組SD大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，置于立體定位儀(Stoslting)上，見圖1。將攜帶HMGB1 shRNA和陰性對照shRNA的慢病毒分別注射于RNA干擾組和陰性干擾組大鼠右側(cè)側(cè)腦室。前囟被定為立體定位原點，前囟向后1.5 mm，向右旁開1.0 mm，深度為顱骨下3.5 mm。注射速度為0.5 μL/min，注射總體積為每只 6 μL，病毒滴度為2×1012TU/L。注射后局部留針5 min后拔針。再灌注7 d后，按照Hayakawa等［5］的方法，采用免疫熒光雙標記HMGB1/GFAP和免疫印跡的方法檢測RNA干擾的結果。

3.3 BrdU標記 采用腹腔注射BrdU的方法對再灌注后腦內(nèi)神經(jīng)干細胞進行標記。于再灌注5 d開始給予BrdU(50 mg/kg)，腹腔注射每天2次，連續(xù)2 d，見圖1。行4%多聚甲醛灌流后，取大鼠(n=6)腦組織按10 μm厚度經(jīng)行冠狀位切片后保存于-80℃。

Figure 1.The time points of lentivirus injection and BrdU injection in focal cerebral ischemia/reperfusion rats.圖1 大鼠局灶腦缺血/再灌注模型注射慢病毒及BrdU時間示意圖

3.4 組織免疫熒光雙標記染色 組織切片放于1%Triton X-100 PBS液中，37℃通透30 min，在pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中微波修復20 min，自然冷卻至室溫;BrdU染色需繼續(xù)進行DNA變性，用2 mol/L HCl 37℃孵育30 min，然后用pH 8.5的硼酸鈉溶液沖洗10 min。PBS液沖洗15 min。置于5%山羊血清中37℃封閉1 h。進行免疫雙標，分別加Ⅰ抗nestin(1∶50)/BrdU(1∶20)和 GFAP(1∶300)/HMGB1(1∶100)4℃過夜。PBS沖洗后，加Ⅱ抗山羊抗兔TRITC(1∶50)和山羊抗小鼠 Alexa Flour 647(1∶200)37℃孵育2 h。抗淬滅封片劑封片。用配備Fluoview FVX共聚焦掃描頭(Leica)的Olympus IX70倒置顯微鏡(Olympus)采集圖像。每組6只大鼠，每只大鼠取非連續(xù)的3張切片，每張切片選取2個視野計數(shù)細胞。

3.5 Western blotting 每組6只大鼠用于Westren blotting檢測。用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后斷頭取腦，取梗死灶周圍的大腦皮質(zhì)放入勻漿器，按每20 mg組織加150 μL RIPA裂解液(含PMSF)的比例，在冰浴條件下加入RIPA裂解液，冰浴裂解30 min，12 000×g離心15 min，取上清液;用BCA蛋白定量法檢測所提蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣量45 μg，電泳分離蛋白條帶，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉37℃封閉90 min，加HMGB1Ⅰ 抗(1∶1 000)，內(nèi)參照選用 β-actin(1∶1 000)，4℃過夜。辣根過氧化物酶標記的抗兔/鼠Ⅱ 抗(1∶5 000)，37℃孵育2 h后用ECL發(fā)光液顯像。利用Bio-Rad apparatus顯影儀顯影，Quantity One 4.6.2軟件分析圖像。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。各組比較采用方差分析;若各組方差齊，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗;若各組方差不齊，組間兩兩比較采用Tamhane檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 腦缺血/再灌注7 d后大鼠大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)內(nèi)HMGB1蛋白的表達

采用免疫熒光雙標記GFAP(星形膠質(zhì)細胞標記物，藍色)和HMGB1(紅色)的表達后顯示:假手術組內(nèi)可見HMGB1蛋白和GFAP陽性細胞均散在分布于腦組織中，且僅有少量HMGB1的表達與GFAP陽性細胞相重疊;與假手術組比較，模型組HMGB1蛋白在梗死周圍區(qū)表達增多，同時伴有GFAP陽性細胞數(shù)明顯增加，且表達HMGB1的GFAP陽性細胞明顯增多;而與模型組比較，RNA干擾組HMGB1蛋白表達明顯被抑制;而陰性干擾組與模型組比較，HMGB1蛋白表達及GFAP陽性細胞均無明顯差別，見圖2A。提示再灌注7 d后梗死周圍區(qū)HMGB1蛋白的表達增多，并伴有星形膠質(zhì)細胞的增多;RNA干擾可以有效抑制HMGB1的表達和星形膠質(zhì)細胞的局部增殖。

Western blotting檢測皮質(zhì)梗死周圍區(qū)HMGB1表達結果顯示:與假手術組比較，模型組和陰性干擾組HMGB1蛋白表達明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，RNA干擾組 HMGB1蛋白的表達明顯降低(P＜0.05)。這提示再灌注7 d后HMGB1蛋白在大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)的表達明顯增多，RNA干擾可以有效抑制HMGB1蛋白表達，見圖2B。

2 BrdU/nestin雙標大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)神經(jīng)干細胞

免疫熒光雙標記BrdU/nestin結果顯示:假手術組大腦皮質(zhì)內(nèi)幾乎沒有被標記的陽性細胞;與假手術組相比，模型組大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)可見大量BrdU/nestin陽性細胞(P＜0.05);而RNA干擾組大腦皮質(zhì)內(nèi)的BrdU/nestin陽性細胞明顯減少(P＜0.05);陰性干擾組的BrdU/nestin陽性細胞與模型組無明顯差別(P＞0.05)。提示模型組大腦皮質(zhì)梗死區(qū)周圍有大量神經(jīng)干細胞增殖，而RNA干擾組當大腦皮質(zhì)內(nèi)HMGB1蛋白表達被抑制時神經(jīng)干細胞的增殖能力也明顯減弱，見圖3。

Figure 2.HMGB1 expression in peri-infarction cortex 7 d after reperfusion.A:double-immunofluorescence labeling with HMGB1(red)and GFAP(blue)in the peri-infarction cortex;B:Western blotting showed the HMGB1 protein expression in the peri-infarction cortex.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.圖2 再灌注7 d后HMGB1在大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)的表達

Figure 3.BrdU(blue)/nestin(red)positive cells in peri-infarction cortex 7 d after reperfusion.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.圖3 再灌注7 d后大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)的BrdU/nestin陽性細胞表達

討 論

腦缺血/再灌注損傷后，海馬顆粒細胞下層、側(cè)腦室周帶及腦梗塞灶的周圍都會出現(xiàn)不同程度的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖，這些增殖的神經(jīng)干細胞可以遷移到梗死區(qū)，并分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞等，參與組織結構重建和神經(jīng)功能的修復［1-3］。但目前關于腦缺血/再灌注損傷后導致神經(jīng)干細胞自發(fā)增殖的內(nèi)在原因尚未明確。既往通過體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞模擬腦缺血/再灌注發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過氧糖剝奪/復氧復糖處理后的星形膠質(zhì)細胞可以增殖、活化并向有壞死細胞的部位聚集［9］。而腦損傷后神經(jīng)干細胞也被激活，并遷移到有星形膠質(zhì)細胞活化的損傷區(qū)［10］。因此腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞在受損區(qū)的活化和聚集可能對神經(jīng)干細胞的增殖具有促進作用。但既往僅通過體外實驗證實離體星形膠質(zhì)細胞有向壞死細胞局部聚集的現(xiàn)象［9］，而無在體實驗的研究。本實驗通過免疫熒光標記星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP觀察到再灌注7 d時大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)星形膠質(zhì)細胞明顯增多，表明該部位有星形膠質(zhì)細胞聚集，該結果與既往離體實驗結果一致，進一步通過在體實驗證實腦缺血/再灌注后星形膠質(zhì)細胞在皮質(zhì)梗死周圍區(qū)聚集的現(xiàn)象。

既往的研究結果證實，腦缺血/再灌注后HMGB1在受損部位表達呈現(xiàn)一個先降低后升高的動態(tài)變化過程。既往通過對大鼠局灶腦缺血/再灌注模型的研究發(fā)現(xiàn)，再灌注1 d時HMGB1的表達明顯下降，之后逐漸升高，至4 d時接近正常水平，之后逐漸高于正常水平，并持續(xù)數(shù)天至數(shù)周［3-4］。通過細胞類型的定位研究發(fā)現(xiàn)再灌注2 d開始，HMGB1就主要由星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞分泌［11］。本實驗通過Western blotting檢測證實，再灌注7 d HMGB1蛋白在大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)的表達明顯高于假手術組;結合免疫熒光雙標檢測發(fā)現(xiàn)，假手術組HMGB1蛋白主要表達于星形膠質(zhì)細胞以外的其它類型的細胞，而模型組HMGB1蛋白則主要表達于星形膠質(zhì)細胞，該結果中HMGB1表達的時間點變化規(guī)律及表達部位與既往的研究結果相符［4-5，11］。

HMGB1在腦缺血/再灌注后的釋放不僅有加重損傷的作用，同時還有促進修復的作用。已有的研究主要關注于腦缺血/再灌注損傷后HMGB1對腦組織的損傷作用，并有研究證實HMGB1的釋放可以促進神經(jīng)元凋亡［12］、腦梗區(qū)的炎癥反應［13］及對血腦屏障的損傷［14］。但最近的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在腦缺血損傷后有促進組織修復的作用，Hayakawa等［5］通過離體實驗和在體實驗均證實星形膠質(zhì)細胞釋放HMGB1可以促進血管內(nèi)皮祖細胞的增殖，并且推斷HMGB1的釋放可以促進神經(jīng)血管單元的重建和腦梗后神經(jīng)功能的恢復。Meneghini等［15］通過體外實驗證實HMGB1通過與神經(jīng)干細胞表面的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體結合可以促進神經(jīng)干細胞增殖。Lei等［7］通過使用膠原酶誘導腦出血模型的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以促進血腫周圍神經(jīng)干細胞的增殖和血管再生。但目前尚未見HMGB1在腦缺血/再灌注損傷后促進神經(jīng)干細胞增殖的報道。本實驗中，我們通過選取腦缺血后神經(jīng)干細胞增殖的高峰期再灌注7 d作為檢測時點［1-3］，通過使用RNA干擾技術抑制皮質(zhì)內(nèi)HMGB1表達發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)梗死周圍區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖受到抑制，說明腦缺血再灌注損傷后HMGB1在腦內(nèi)的表達有促進損傷部位神經(jīng)干細胞的增殖作用。結合既往的研究結果［4］，我們進一步推斷局灶腦缺血/再灌注損傷后HMGB1在腦梗周圍區(qū)表達可能通過促進血管再生和神經(jīng)再生共同促進腦組織結構重建和神經(jīng)功能恢復。但局部增殖的神經(jīng)干細胞是否可以在后期繼續(xù)向神經(jīng)元分化，并與周圍的神經(jīng)進一步形成突觸連接尚有待進一步研究。

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