高效液相色譜法測(cè)定精制紅花油中亞油酸含量

韓紅梅，高 鈞，郝 福，劉艷麗，劉軍鋒

(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司·河北省中藥注射劑工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 051430)

五福心腦清軟膠囊含有精制紅花油、冰片、維生素E和維生素B6，具有活血散瘀、通經(jīng)止痛、開(kāi)竅醒神的功效，可治療瘀血阻滯所致的中風(fēng)、中經(jīng)絡(luò)、半身不遂、口眼歪斜、胸痹心痛。精制紅花油為其主要藥效成分，是從紅花油皂化物中提取的以亞油酸為主的不飽和脂肪酸混合物。目前，油脂中的脂肪酸、游離脂肪酸的分析、測(cè)定多采用甲酯衍生化－氣相色譜法[1－2]，但該法前處理煩瑣、費(fèi)時(shí)，誤差較大，且測(cè)定的是油脂中脂肪酸甲酯和游離脂肪酸的總和，不能單獨(dú)測(cè)定游離脂肪酸。也有采用超高效液相色譜－蒸發(fā)光散射方法直接測(cè)定游離脂肪酸含量的報(bào)道[3]，而采用高效液相色譜－紫外法測(cè)定游離脂肪酸含量，尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者為控制產(chǎn)品質(zhì)量，建立了測(cè)定精制紅花油中亞油酸含量的高效液相色譜(HPLC)法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器。亞油酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111622－200301，規(guī)格為每支0．2 mL);精制紅花油(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為20120301，20120302，20120303，20120304，20120305，20120306，20120307，20120308，20120309，20120310);乙腈，甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司);水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent SB －C18柱 (250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－水(75∶25);柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;流速:1 mL/min。在此條件下，亞油酸對(duì)照品和精制紅花油樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

2．2 溶液制備

稱(chēng)取精制紅花油約140 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，再精密吸取1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱(chēng)取亞油酸對(duì)照品125．7 mg，置25 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，精密吸取1 mL，置 25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取亞油酸對(duì)照品溶液 0．5，1．0，3．0，5．0，7．0，10．0 μL，依法進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積積分值，以亞油酸進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=1 732．9 X+12．38(r=0．999 9，n=6)。結(jié)果表明，亞油酸進(jìn)樣量在0．09～1．8 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取亞油酸對(duì)照品溶液5 μL，依法進(jìn)樣分析，連續(xù)6次。結(jié)果峰面積的 RSD為0．6%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為20120301)6份，依法制備供試品溶液，各吸取5 μL進(jìn)樣分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算亞油酸含量。結(jié)果含量的 RSD為1．0%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取9份精制紅花油樣品(批號(hào)為20120301，含量為90．6%)適量，精密稱(chēng)定，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的亞油酸對(duì)照品溶液5 mL，按供試品溶液制備下方法制備溶液，依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 亞油酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液(批號(hào)為20120309)，分別于制備后 0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD=1．05%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．4 樣品含量測(cè)定

分別稱(chēng)取各批精制紅花油樣品，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算亞油酸含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

精制紅花油為五福心腦清軟膠囊的主要藥效成分，紅花油中含有多種游離脂肪酸。游離脂肪酸熔點(diǎn)較高，不適合直接采用氣相色譜法測(cè)定，傳統(tǒng)方法采用甲酯衍生化，再用氣相色譜法測(cè)定。該方法前處理煩瑣、費(fèi)時(shí)，誤差較大。高效液相色譜法可不進(jìn)行前處理而直接測(cè)定游離脂肪酸的含量。本試驗(yàn)中試用203 nm波長(zhǎng)紫外末端吸收檢測(cè)法，方法學(xué)考察表明，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求，可作為精制紅花油中亞油酸含量測(cè)定方法。

表2 精制紅花油中亞油酸含量測(cè)定結(jié)果

10批樣品的亞油酸含量測(cè)定結(jié)果表明，精制紅花油中亞油酸含量波動(dòng)不大，說(shuō)明其質(zhì)量穩(wěn)定，為五福心腦清的質(zhì)量提供了很好的保障。

[1]楊 潔，王雪娜，劉 萍．萊菔子脂肪酸成分的氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析[J]．中國(guó)藥業(yè)，2009，18(4):26－27．

[2]王玲波，孫 暉．氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析紫草籽油脂肪酸的化學(xué)成分[J]．中國(guó)藥業(yè)，2008，17(16):23．

[3]李一哲，包桂蓉，王 華．超高效液相色譜法測(cè)定生物柴油中的11種脂肪酸及脂肪酸甲酯[J]．色譜，2008，26(4):494－498．