PUMA介導(dǎo)大蒜素誘導(dǎo)人卵巢癌耐順鉑SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡

吳金蘭，萬慧芳，涂 碩， 朱偉鋒，余樂涵，萬福生*

(1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室，江西南昌 330006;2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌 330006)

卵巢癌是女性生殖道最常見三大惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科癌癥首位［1-2］?；熓悄壳爸委熉殉舶┑闹匾侄沃?化療耐藥是卵巢癌復(fù)發(fā)和治療失敗的主要原因之一。因此，尋求抗耐藥、毒性小、對卵巢癌治療有效的藥物勢在必行。大蒜素(diallyl trisulfide，DT)是大蒜中主要生物活性成分的總稱，又名大蒜新素，化學(xué)名為三硫化二丙烯(二烯丙基三硫化物)。有研究表明，大蒜素對肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤均有明顯的抑制作用［3-4］。本實(shí)驗(yàn)采用大蒜素單獨(dú)或與順鉑聯(lián)合作用于卵巢癌耐順鉑株SKOV-3/DDP細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞生長的抑制、促凋亡作用及PUMA在大蒜素誘導(dǎo)SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡中的作用，旨在探討大蒜素抗腫瘤作用特點(diǎn)及其分子機(jī)制，為臨床治療耐順鉑卵巢癌患者化療藥物的篩選提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體 人上皮性卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株(SKOV-3/DDP)購自北京腫瘤醫(yī)院。大蒜素購自上海市禾風(fēng)制藥有限公司 (批號0909302)，順鉑(Cisplatin，DDP)購于山東羅欣藥業(yè)股份有限公司 (批號10050501);RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購于GIBCO公司，MTT試劑盒為Ameresco公司產(chǎn)品，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司。PUMA多克隆抗體 (ab9643)為Abcam公司產(chǎn)品，Bcl-2多克隆抗體 (sc-783)、Bax多克隆抗體 (sc-526)及β-actin單克隆抗體 (TA-09)購于Santa Cruz公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-2301)和辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(ZB-2305)購自北京中杉金橋公司;caspase-3活性檢測試劑盒 (碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 體外培養(yǎng)人上皮性卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株SKOV-3/DDP，細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，隨機(jī)分為正常對照組、大蒜素處理組、順鉑處理組和大蒜素+順鉑組4個組，每個組設(shè)置三個復(fù)孔。①正常對照組:正常培養(yǎng)的SKOV-3/DDP細(xì)胞;②大蒜素處理組:于培養(yǎng)基中加入大蒜素 (終質(zhì)量濃度分別為 5、10、20、40 μg/mL);③順鉑處理組:于培養(yǎng)基中加入順鉑 (終質(zhì)量濃度為5 μg/mL);④大蒜素+DDP處理組:于培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度5 μg/mL順鉑和20 μg/mL大蒜素。

1.3 Hoechst33342熒光染色法 用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，制作細(xì)胞爬片。藥物作用SKOV-3/DDP細(xì)胞48 h后，加入10 μg/mL的Hoechst33342，繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h;棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌3次直接在熒光顯微鏡下觀察并拍照。每個組設(shè)置3個實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡率采用Annexin V-FITC和PI聯(lián)合染色的流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，并可區(qū)分出早期、晚期凋亡。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集處理后的細(xì)胞，用PBS洗滌2次 (2000 r/min離心5 min)收集1×105～5×105個細(xì)胞后，加入結(jié)合500 μL緩沖液懸浮細(xì)胞，然后按照試劑盒說明分別加入染料5 μL的AnnexinⅤ、5 μL的PI，室溫、避光、孵育15 min，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 RT-PCR分析 SKOV-3/DDP細(xì)胞中 PUMA、bax、bcl-2 mRNA表達(dá) 提取總RNA，操作按照Invitrogen/TRIzol試劑盒說明進(jìn)行;cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成操作按Fermentas試劑盒說明進(jìn)行，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后1.5%瓊脂糖凝膠檢測。于凝膠成像系統(tǒng)拍照，應(yīng)用Launch SensiAnsys凝膠分析系統(tǒng)軟件分析，以β-actin產(chǎn)物條帶為對照，計(jì)算并比較各組目的基因的相對表達(dá)量。

附引物序列Sequence of the primers

1.6 Western blot檢測 SKOV-3/DDP細(xì)胞中 PUMA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 收集并裂解細(xì)胞，收集總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，每孔樣本總蛋白的量為30 μg。隨后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)膜上。然后將膜與PUMA，Bax，Bcl-2(1∶200)抗體反應(yīng)。4℃過夜后，將膜與辣根過氧化物酶連接的二抗 (1∶2000)反應(yīng)1.5 h。最后，暗室內(nèi)進(jìn)行ECL免疫檢測。用 Image-Pro Plus6.0凝膠圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值掃描，以內(nèi)參條帶β-actin為對照對條帶進(jìn)行半定量分析。

1.7 PUMA特異性siRNA對大蒜素誘導(dǎo)SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)人PUMA(cDNA)序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成PUMA特異的siRNA片段 (5'-GGGUCCUGUACAAUCUCAUTT-3'，5'-AUGAGAUUGUACAGGACCCTT-3')。使用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染PUMA siRNA(si-PUMA)進(jìn)入SKOV-3/DDP細(xì)胞后，檢測大蒜素對SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡率的影響以及相關(guān)蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)分成6組，分別是正常對照組:棄去細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)液后，更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h，再換上完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h;陰性對照組:轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA分子，其余操作同正常對照組;SiRNA組:轉(zhuǎn)染Si-PUMA片段Ⅰ，其余操作同正常對照組;SiRNA+大蒜素組:轉(zhuǎn)染Si-PUMA片段6 h后，更換為含質(zhì)量濃度為20 μg/mL大蒜素的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡的影響 SKOV-3/DDP細(xì)胞經(jīng)大蒜素和順鉑處理48 h后凋亡率變化如圖1所示。與正常對照組 (4.53±1.12)%比較，3個劑量的大蒜素組、順鉑組及順鉑+大蒜素處理組早期凋亡率均有顯著性升高 (P＜0.05或P＜0.01)，與DDP組或大蒜素組比較，順鉑+大蒜素組早期凋亡率 (31.5±3.1)% 仍有顯著增加 (P＜0.01)。提示順鉑與大蒜素聯(lián)用效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。

2.3 PUMA特異性siRNA對大蒜素誘導(dǎo)SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡的影響 特異性干擾SKOV-3/DDP細(xì)胞 PUMA表達(dá)后，用大蒜素 20 μg/mL作用SKOV-3/DDP細(xì)胞48 h，檢測其細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)(圖2)，si-PUMA組的早/晚期凋亡率與正常對照組相比，均出現(xiàn)明顯降低現(xiàn)象 (P＜0.05)。si-PUMA+大蒜素組晚期細(xì)胞凋亡率與si-PUMA組相比有明顯升高 (P＜0.05)。

圖1 大蒜素及順鉑對SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡率的影響Fig.1 Effects of diallyl trisulfide and cisplatin on apoptosis rates in the SKOV-3/DDP cell

圖2 PUMA特異性siRNA對大蒜素誘導(dǎo)SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of PUMA specific siRNA on apoptosis induced by diallyl trisulfide in the SKOV-3/DDP cell

2.4 熒光顯微鏡觀察 熒光顯微鏡觀察可見，藥物作用48 h后，各組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈核固縮，染色質(zhì)凝聚，染色加深，呈新月形附于核膜周圍，并隨大蒜素劑量增加而加強(qiáng)，其中大蒜素40 μg/mL組可見細(xì)胞核破碎，呈大小不等的熒光碎片。表明大蒜素能夠誘導(dǎo)人卵巢癌耐順鉑SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡。順鉑組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，而當(dāng)大蒜素+順鉑組可見細(xì)胞核破碎明顯增多，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的熒光碎片 (圖3)。結(jié)果提示大蒜素與順鉑兩藥聯(lián)用能顯著提高人卵巢癌耐順鉑細(xì)胞SKOV-3/DDP凋亡率。

圖3 SKOV-3/DDP細(xì)胞的形態(tài)變化 (Hoechst 33342熒光染色，×1000)Fig.3 Morphology of SKOV-3/DDP cell by Hoechst33342 staining

2.5 SKOV-3/DDP細(xì)胞中PUMA、bax、bcl-2 mRNA的表達(dá)水平 由圖4結(jié)果顯示:與對照組比較，DDP、大蒜素組均可上調(diào)PUMA、bax mRNA表達(dá)，下調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá) (P＜0.05或P＜0.01)，且順鉑+大蒜素組上調(diào)PUMA、bax mRNA表達(dá)及下調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá)的程度大于單用組 (P＜0.05)。結(jié)果提示大蒜素對PUMA、bax、bcl-2 mRNA表達(dá)均有一定的調(diào)控作用，且大蒜素與順鉑聯(lián)用能提高作用效果。

2.6 SKOV-3/DDP細(xì)胞中 PUMA、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 結(jié)果顯示 (圖5)，與對照組比較，順鉑、大蒜素組均可上調(diào)PUMA、Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá) (P＜0.05或P＜0.01)，且順鉑+大蒜素組上調(diào)PUMA、Bax蛋白表達(dá)及下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)的程度大于單用組 (P＜0.05)。結(jié)果提示大蒜素對PUMA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)有調(diào)控作用，大蒜素與順鉑聯(lián)用有協(xié)同作用。

2.7 特異性沉默PUMA后SKOV-3/DDP細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)變化 結(jié)果顯示 (見圖6)，si-PUMA組SKOV-3/DDP細(xì)胞中PUMA和Bax蛋白表達(dá)較正常對照組有顯著性下降 (P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)呈顯著性上升 (P＜0.05);Si-PUMA+大蒜素組細(xì)胞中PUMA蛋白表達(dá)呈顯著性下調(diào)(P＜0.05);與Si-PUMA組比較，Si-PUMA+大蒜素組PUMA和Bax蛋白表達(dá)呈顯著性上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)呈顯著性下調(diào) (P＜0.05);而陰性對照組的PUMA、Bax和Bcl-2蛋白水平與C正常對照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 SKOV-3/DDP細(xì)胞中PUMA、bax、bcl-2 mRNA表達(dá)變化Fig.4 mRNA expressions of PUMA，bax and bcl-2 in SKOV-3/DDP cells

圖5 SKOV-3/DDP細(xì)胞中PUMA、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Protein expressions of PUMA，Bax and Bcl-2 in SKOV-3/DDP cells

圖6 PUMA沉默后SKOV-3/DDP細(xì)胞中PUMA、Bax及bcl-2蛋白水平Fig.6 Protein expressions of PUMA，Bax and Bcl-2 after the silencing of PUMA expression in SKOV-3/DDP cells

3 討論

化療藥物對腫瘤細(xì)胞殺傷作用的一個重要方式是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞對化療藥物的不敏感及毒副作用嚴(yán)重影響了化療藥在臨床中的應(yīng)用。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡經(jīng)典途徑有三條途徑，即線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑。線粒體凋亡途徑主要與bcl-2基因家族的調(diào)控密切相關(guān)［6-8］。大蒜素抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制與其抗氧化作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期等有關(guān)［9-10］。Hassan等［11］研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可通過調(diào)節(jié)人白血病CD34陽性細(xì)胞bcl-2基因和caspase-3蛋白的表達(dá)，提高化療藥物促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用。張鈞書等［12］研究表明，大蒜素可增強(qiáng)紫杉醇對胃癌細(xì)胞的增值抑制作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)bax和下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)和下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)［13］。本研究結(jié)果表明，大蒜素對卵巢癌SKOV-3/DDP細(xì)胞增殖有較好的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可調(diào)控PUMA、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)，兩藥聯(lián)用對細(xì)胞增殖抑制作用顯示出有共同 (相加)作用效果。本實(shí)驗(yàn)從線粒體凋亡途徑探討了大蒜素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大蒜素可能通過上調(diào)PUMA表達(dá)，從而上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

研究報(bào)道PUMA在許多藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用［14-15］，如順鉑刺激后可以引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死以及出現(xiàn)腎損傷，同時發(fā)現(xiàn)PUMA表達(dá)出現(xiàn)增加［15］。順鉑誘導(dǎo)PUMA表達(dá)具有時間和劑量依賴性。毛正果等［4］報(bào)道大蒜素在誘導(dǎo)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡時PUMA表達(dá)增加，而抑制PUMA表達(dá)后大蒜素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用明顯減弱。Wang等［16］用綠茶多酚處理腸癌細(xì)胞LoVo后，發(fā)現(xiàn)了同樣的作用。次黃芩素作用于前列腺癌細(xì)胞LNCaP后，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)PUMA蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放，Caspases級聯(lián)反應(yīng)被激活［17］。通過RNAi，發(fā)現(xiàn)si-PUMA轉(zhuǎn)染組使SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)明顯降低，而si-PUMA+大蒜素組的細(xì)胞凋亡率較si-PUMA轉(zhuǎn)染組有明顯上升。在si-PUMA明顯下調(diào)SKOV-3/DDP細(xì)胞內(nèi)PUMA蛋白表達(dá)的同時，si-PUMA組Bax蛋白表達(dá)水平與正常對照組相比出現(xiàn)明顯下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平與正常對照組相比呈現(xiàn)明顯上調(diào)。與si-PUMA組相比，si-PUMA+大蒜素組輕度上調(diào)了PUMA、Bax蛋白水平以及輕度下調(diào)了Bcl-2蛋白水平。以上結(jié)果表明，大蒜素和順鉑聯(lián)合應(yīng)用對促進(jìn)人卵巢癌耐順鉑SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡有較好的抑制作用。PUMA是Bcl-2家族中BH3-only蛋白家族成員，表現(xiàn)出強(qiáng)大而全面的促凋亡作用［18］。提示PUMA在大蒜素誘導(dǎo)SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，為大蒜素的抗腫瘤作用提供了一個新的分子靶點(diǎn)。

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