板藍(lán)根多肽在人工胃腸環(huán)境中的降解研究

劉西京，南 楠，，侯安國

(1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055;2云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之效［1］。藥理研究證明板藍(lán)根具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗內(nèi)毒素、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等作用［2-3］，臨床上主要用于病毒性疾病及細(xì)菌感染性疾病的治療［4］。

關(guān)于板藍(lán)根清熱解毒的物質(zhì)基礎(chǔ)研究有大量報道，如陳凱等認(rèn)為總氨基酸和總生物堿是其抗炎的有效部位［5］;何立巍等認(rèn)為多糖可能為板藍(lán)根的活性成分之一［6］;也有學(xué)者認(rèn)為有機酸是板藍(lán)根的有效成分［7］;徐麗華等發(fā)現(xiàn)水提物、總生物堿、表告依春有較強的抗病毒作用［8］;也有學(xué)者認(rèn)為，板藍(lán)根藥材中的尿苷、鳥苷、腺苷等核苷類成分是其主要活性成分［9］。

盡管研究眾多，但仍缺乏共識。本課題組研究發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根植物含多肽量較高，又有良好的體內(nèi)外抗病毒效果。本實驗擬模擬胃腸環(huán)境研究板藍(lán)根多肽的降解情況，為進(jìn)一步深入研究板藍(lán)根抗病毒活性成分和藥理作用提供實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 藥品與試劑 板藍(lán)根 (產(chǎn)地甘肅);胃蛋白酶、胰蛋白酶、十二烷基磺酸鈉 (SDS)、Bis-Acrylamide、Acrylamide、硫酸銨 (AP)(均為Sigma公司);TEMED(Aldrich公司);SDS-PAGE蛋白標(biāo)準(zhǔn) (Pharmacia低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn));4×上樣緩沖液 (Fermentas);考馬斯亮藍(lán) R-250(Amresco分裝);硝酸銀 (成都化學(xué)試劑廠);硫酸銨 (岳陽寶慶化工);10 kD超濾離心管 (Millipore);BCA試劑盒(碧云天生物);甲醇、乙腈 (Merck色譜純);乙醇 (天津市化學(xué)試劑分析純);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、冰乙酸 (均為天津南開化工廠分析純);DNFB(西亞試劑);Tris(Serva公司)。

1.2 儀器 Multiskan MK3全自動酶標(biāo)儀 (Thermo公司);Agilent 1100高效液相色譜儀;Eclipse XDB C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司);KY-IA恒溫?fù)u床 (金壇市岸頭良友實驗儀器廠);Avanti J30I大容量冷凍離心機;ALPLTA 1-2冷凍干燥機 (CHRIST公司);Milli-Q超純水機 (Milipore公司);移液器 (Eppendorf公司);小型垂直電泳系統(tǒng) (Bio-Rad公司);170-8170凝膠成像分析儀(Bio-rad公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 板藍(lán)根總肽的制備 取藥材適量，粉碎過二號篩，加10倍量超純水浸提24 h，10000 r/min離心取上清，加(NH4)2SO4至體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置過夜，5000 r/min離心取沉淀，凍干得板藍(lán)根總肽，實驗時加蒸餾水配制成0.25 g/L多肽溶液。

2.2 板藍(lán)根多肽在人工胃液或人工腸液中的降解研究 取7支1.5 mL離心管，每管加入人工胃液或人工腸液100 μL，37℃水浴恒溫，然后分別加入多肽溶液 (37℃預(yù)溫)100 μL，37 ℃ 消化。分別于 0、1、5、15、30、90、180 min取樣，加入0.168 mol/L Na2CO3適量，調(diào)節(jié)pH使酶解反應(yīng)終止。離心取上清液，以空白胃腸液作為對照，BCA法檢測蛋白濃度［10］;以SDS-PAGE法檢測板藍(lán)根多肽的降解情況。

2.2.1 SDS-PAGE法檢測板藍(lán)根多肽降解情況 由圖1可知，板藍(lán)根多肽主要相對分子質(zhì)量約為26～100 kD，其中26 kD附近蛋白量最高，34 kD處次之，其他相對分子質(zhì)量的多肽豐度相對較低，不成條帶，36 kD處為胃蛋白酶條帶。經(jīng)人工胃液消化后，0～5 min內(nèi)消化產(chǎn)物電泳圖譜無明顯差別，隨時間延長，26 kD附近條帶明顯變淺，34 kD處無明顯變化，無新條帶產(chǎn)生。

圖1 板藍(lán)根多肽經(jīng)人工胃液降解后的SDSPAGE電泳譜圖

經(jīng)人工腸液消化 (見圖2)，24 kD附近的條帶為胰蛋白酶的條帶，隨著時間的變化，34 kD處條帶漸漸變淺，26 kD處條帶無明顯變化。

圖2 板藍(lán)根多肽經(jīng)人工腸液降解后的SDSPAGE電泳譜圖

2.2.2 BCA法測定板藍(lán)根多肽在人工胃液和人工腸液中的變化 板藍(lán)根多肽經(jīng)人工胃液消化后，1 min內(nèi)板藍(lán)根多肽量下降，而后顯著上升，在15 min時達(dá)到峰值，其后緩慢下降，到90 min后基本穩(wěn)定。經(jīng)人工腸液消化后，1 min內(nèi)板藍(lán)根多肽量下降，而后緩慢上升，在45 min達(dá)到峰值，其后至180 min緩慢下降。見圖3。

圖3 消化后多肽變化曲線

2.3 HPLC法測定氨基酸 采用2，4-二硝基氟苯 (DNFB)柱前衍生化法測定樣品中游離氨基酸［11］。

2.3.1 樣品制備 精密稱取5 g板藍(lán)根粉末，粉碎過二號篩，加10倍量超純水浸提24 h，6000 r/min離心15 min，取上清液。置于蒸發(fā)皿中揮發(fā)至約50 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻。以“2.2”項法操作，進(jìn)樣10 μL，即得。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 蘇氨酸、脯氨酸、精氨酸、纈氨酸線性方程分別為 A=8262C +45.299、A=4629.3C +1306.1、A=604.02C+255.37、A=8703.5C － 4.3392，線性范圍分別為0.0117～1.17、0.067～6.7、0.2954～29.54、0.0044 ～0.44 μg。

2.3.3 色譜條件 Agilent ODS C18色譜柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm);流動相A為0.014 mol/L磷酸鹽緩沖液 (用磷酸二氫鈉調(diào)pH 8.2)，流動相B為乙腈水溶液 (V乙腈∶V水=1∶1)，梯度洗脫 (0～20 min，20% ～80%B);體積流量1 mL/min;柱溫30℃。檢測波長為360 nm(0～8.2 min)，398 nm(8.2～10.0 min)，360 nm(10～20 min);進(jìn)樣量10 μL;步長4 nm。結(jié)果見表1。

表1 板藍(lán)根多肽消化前后氨基酸變化情況

由結(jié)果可知，除了經(jīng)人工腸液消化降解后，精氨酸的量有一定程度的增加外，其他游離氨基酸無明顯變化。

3 討論

3.1 根據(jù)實驗結(jié)果可知，板藍(lán)根多肽主要集中在相對分子質(zhì)量約為26～100 kD之間，尤其是以26 kD和34 kD附近為主。經(jīng)人工胃液消化后，隨著時間的推移，26 kD附近條帶明顯變淺，34 kD附近條帶基本無明顯變化。與此相反，經(jīng)人工腸液消化后，隨著時間的推移，34 kD附近條帶明顯變淺，26 kD附近條帶基本無明顯變化，說明經(jīng)過胃腸液作用后，板藍(lán)根多肽被降解破壞。

為了測定的準(zhǔn)確性，故選板藍(lán)根中主要的蘇氨酸、脯氨酸、精氨酸和纈氨酸進(jìn)行測定。HPLC測定結(jié)果表明，經(jīng)過人工胃腸液消化后，除精氨酸的量有少量增加外，其余氨基酸無明顯變化;BCA法測定結(jié)果表明，經(jīng)消化后胃腸液中仍有大量多肽。

以上結(jié)果綜合可知，經(jīng)過人工胃腸液消化后，板藍(lán)根多肽有了降解變化，但氨基酸的變化不明顯，說明板藍(lán)根多肽降解成了小分子多肽，而沒有進(jìn)一步分解成游離氨基酸，BCA法測定結(jié)果也證實了這一結(jié)果。

3.2 最初測定總肽消化前后氨基酸的變化情況時，由于氨基酸含有量極低，不容易測定，因此，用水提液進(jìn)行消化測定，提高了測定的準(zhǔn)確度。

3.3 傳統(tǒng)認(rèn)為蛋白或高分子多肽只有被水解為氨基酸后才能被人體或動物吸收，后來發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在消化道的降解產(chǎn)物大部分是小分子多肽，他們以完整形式被吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)而被組織利用，與游離氨基酸相比，小肽吸收具有吸收快、耗能低、吸收率高等優(yōu)勢。對于板藍(lán)根的物質(zhì)基礎(chǔ)到底為何眾多學(xué)者進(jìn)行了有益的探索，本課題組研究板藍(lán)根的水提醇沉液時，經(jīng)陽離子樹脂后氨洗得到多肽部分，占水提醇沉后固體量一半左右。經(jīng)過初步藥理實驗表明板藍(lán)根多肽具有一定抗流感病毒的作用，認(rèn)為板藍(lán)根有效部位為多肽，與報道［12］相符。本實驗結(jié)果也證明，板藍(lán)根多肽在體內(nèi)主要降解成小分子肽被吸收，在《中國藥典》2010年版中，把氨基酸作為定性鑒別也值得商榷。由于多肽活性的多樣性，有必要對植物多肽研究引起足夠的重視，而不是傳統(tǒng)的當(dāng)做雜質(zhì)而除去。

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