贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制初探

錢立娜，楊玉梅，覃建民，應(yīng) 康，徐繼輝，張長(zhǎng)在

(1.內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010065;2.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

“贊丹-3湯散”是由白檀香、廣棗、肉豆蔻等組成的傳統(tǒng)蒙藥制劑，為蒙醫(yī)治療心血管系統(tǒng)疾病的常用藥劑，療效顯著，在內(nèi)蒙古各族人民、特別是廣大牧民中廣泛應(yīng)用。但其作用機(jī)制尚不明確，且傳統(tǒng)散劑加工很粗糙，不利于吸收，對(duì)于消化功能不良者其藥效受到影響;同時(shí)傳統(tǒng)的簡(jiǎn)單粉碎工藝，對(duì)其中所含的芳香揮發(fā)性有效成分造成散失，影響療效。目前對(duì)贊丹-3湯散進(jìn)行劑型改革，將其制成了大滴丸。本實(shí)驗(yàn)擬觀察贊丹-3湯滴丸對(duì)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈所致急性心肌缺血及缺血性心律失常的保護(hù)作用并初步探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供的健康Wistar大鼠 (清潔級(jí))，動(dòng)物許可證號(hào) SCXK(蒙)2002-0001。

1.2 藥品 贊丹-3湯滴丸內(nèi)容物 (由湛江海洋大學(xué)理學(xué)院提供，批號(hào)080501，臨用時(shí)用蒸餾水配成所需質(zhì)量濃度的混懸液);復(fù)方丹參片 (北京同仁堂制藥廠，批號(hào)8121180);紅四氮唑染色劑 (北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)20080306);超氧化物歧化酶試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號(hào)20080410);丙二醛試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號(hào)20080412);一氧化氮試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號(hào)20080415);肌酸激酶試劑盒 (南京建成生物工程研究所，批號(hào)20080408);NF-κB p65試劑盒 (北京百奧泰斯公司，批號(hào)20080524)。

1.3 儀器 BL-420型生物機(jī)能系統(tǒng) (成都盟泰科技有限公司);DH-140型動(dòng)物人工呼吸機(jī) (浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠);BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) (盟泰科技公司);DZKM型電子恒溫水浴鍋 (北京市光明醫(yī)療儀器廠);721-B型分光光度計(jì) (上海第三分析儀器廠);離心機(jī) (北京醫(yī)療儀器修理廠)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，平均體質(zhì)量 (220±60)g，隨機(jī)分為:假手術(shù)組 (生理鹽水0.02 L/kg)，缺血模型組 (生理鹽水0.02 L/kg);復(fù)方丹參組 (0.3 g/kg);贊丹-3湯滴丸組 (0.3、0.15、0.075 g/kg)劑量組。所有大鼠均以0.02 L/kg灌胃給藥32 d，1次/日，于末次給藥30 min后制備模型。實(shí)驗(yàn)期間各組動(dòng)物一般情況良好，無死亡，實(shí)驗(yàn)開始與結(jié)束各組大鼠體質(zhì)量差別均無顯著性。

2.2 模型制備［1-2］以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，針形電極插入肢體皮下通過BL-420生物機(jī)能系統(tǒng)記錄正常Ⅱ?qū)碾妶D。在人工呼吸機(jī)輔助下，于胸骨左側(cè)第3～4肋間開胸，剪開心包膜擠出心臟，用0號(hào)線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支 (假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎)，迅速將心臟送回胸腔，縫合胸壁。

2.3 檢測(cè)指標(biāo) 記錄缺血前心電圖及缺血30 min內(nèi)心律失常發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、室顫發(fā)生率;模型制備成功5 h后，取血制備血清，嚴(yán)格按照說明書測(cè)定 SOD、MDA、CK、NO的活性及水平;取出心臟，將左室切成相等厚度的5片，用1%TTC溶液37℃恒溫水浴染色20 min，未壞死區(qū)為暗紅色，壞死區(qū)呈白色，將壞死區(qū)和非壞死區(qū)分別稱重，計(jì)算壞死區(qū)占左心室質(zhì)量的百分比，即梗死范圍;將心肌組織進(jìn)行固定、包埋，進(jìn)行常規(guī)切片，HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變;免疫組化染色檢測(cè)NF-κB p65的活性表達(dá)，用BI-2000圖像分析系統(tǒng)對(duì)其陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示，計(jì)量資料組間比較用LSD－t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠急性缺血性心律失常的作用 各組大鼠 (除假手術(shù)組)造模后30 min內(nèi)心律失常的發(fā)生率為100%，主要表現(xiàn)為室性心律失常，多與竇性心律交替出現(xiàn)，可逐漸恢復(fù)為竇性心律。復(fù)方丹參組及贊丹-3湯滴丸0.30、0.15 g/kg組與缺血模型組比較，能明顯延遲心律失常發(fā)生時(shí)間，并縮短心律失常持續(xù)時(shí)間，降低室顫發(fā)生率 (P＜0.05或P＜0.01);贊丹-3湯滴丸0.075 g/kg組亦顯示此趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，見表1。

表1 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠急性心肌缺血心律失常的影響(，n=10)

表1 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠急性心肌缺血心律失常的影響(，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與缺血模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg －1)心律失常發(fā)生時(shí)間/min心律失常持續(xù)時(shí)間/min室顫發(fā)生率/%假手術(shù)組 －00 0缺血模型組 － 5.72±1.44# 13.23±3.64# 90#贊丹-3湯滴丸 0.300 9.76±2.47＊＊ 9.70±3.17＊＊ 20＊＊0.150 7.97 ±2.35* 10.20 ±3.85* 30＊＊0.075 6.74±2.84 11.17±2.57 70復(fù)方丹參組 0.300 10.14±2.86＊＊ 8.80±1.85＊＊ 10＊＊

3.2 贊丹-3湯滴丸對(duì)缺血5 h后大鼠血清中SOD、NO、CK、MDA的影響 贊丹-3湯滴丸各劑量組和復(fù)方丹參組與缺血模型組比較均可提高血清中SOD和NO水平 (P＜0.05或P＜0.01)，并降低MDA水平和CK活性 (P＜0.05或P＜0.01)，見表2。

表2 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌缺血時(shí)血清SOD、MDA、CK、NO的影響 (，n=10)

表2 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌缺血時(shí)血清SOD、MDA、CK、NO的影響 (，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與缺血模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量/(g·kg－1)T-SOD/(U·mL －1)MDA/(nmol·mL － 1)CK/(U·mL －1)NO/(μmol·L －1)157.1±15.8 9.9±2.2 1.43±0.43 48.9±14.3缺血模型組 － 130.9±16.1# 16.1±4.8# 2.13±0.53# 29.1±8.7#贊丹-3湯滴丸組 0.300 156.4±11.4＊＊ 10.8±2.6＊＊ 1.54±0.37＊＊ 44.2±12.2＊＊0.150 155.1±10.4＊＊ 11.9±4.1* 1.51±0.43＊＊ 42.1±12.6*0.075 149.6±12.4* 12.1±4.1* 1.67±0.42* 40.3±13.6*復(fù)方丹參組 0.300 154.9±18.8＊＊ 10.7±3.5＊＊ 1.58±0.45＊＊ 41.1±12.1假手術(shù)組 －*

3.3 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌梗死范圍的影響 贊丹-3湯滴丸0.30、0.15 g/kg劑量組和復(fù)方丹參組與缺血模型組比較均可使心肌梗死范圍縮小 (P＜0.05或P＜0.01)，贊丹-3湯滴丸0.075 g/kg組也有此趨勢(shì) (P＞0.05)，見表3。

表3 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌缺血心肌梗死范圍的影響(，n=10)

表3 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌缺血心肌梗死范圍的影響(，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與缺血模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg－1) 心肌梗死范圍/%假手術(shù)組 －0缺血模型組 － 23.79±7.70#贊丹-3湯滴丸組 0.300 15.19±5.82＊＊0.150 17.59±5.72*0.075 20.47±6.77復(fù)方丹參組 0.300 14.47±4.67＊＊

3.4 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 病理結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，無明顯變性、壞死等病理改變;缺血模型組出現(xiàn)心肌纖維嚴(yán)重破壞，排列紊亂、溶解、斷裂;復(fù)方丹參組心肌細(xì)胞排列較紊亂，心肌纖維有散在的空泡，少數(shù)肌間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn);贊丹-3湯滴丸0.30 g/kg劑量組心肌纖維排列尚整齊，橫紋清晰，間質(zhì)輕度水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);贊丹-3湯滴丸0.15 g/kg劑量組，心肌細(xì)胞排列略稀疏，橫紋較清晰，間質(zhì)可見擴(kuò)張血管，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)輕度水腫;贊丹-3湯滴丸0.075 g/kg劑量組心肌細(xì)胞排列較紊亂，間質(zhì)可見血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)水腫。

3.5 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌缺血5h后NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)極少，且定位于胞漿;模型組中NF-κB p65蛋白的表達(dá)量明顯上升，細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)均明顯增多;復(fù)方丹參組和贊丹-3湯滴丸各劑量組與模型組比較均有不同程度的NF-κB p65蛋白表達(dá)下降。

缺血模型組與假手術(shù)組比較，NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高 (P＜0.01);復(fù)方丹參組和贊丹-3湯滴丸各劑量組與缺血模型組比較，可明顯降低心肌組織NF-κB p65蛋白的表達(dá) (P＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (見表4)。

表4 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌缺血損傷后NF-κB P65蛋白的影響 (，n=10)

表4 贊丹-3湯滴丸對(duì)大鼠心肌缺血損傷后NF-κB P65蛋白的影響 (，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與缺血模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(g·kg－1) 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/個(gè)3.90±1.66缺血模型組 － 25.80±4.47#贊丹-3湯滴丸組 0.300 13.20±3.97＊＊0.150 15.10±5.60*0.075 18.10±5.38*復(fù)方丹參組 0.300 11.70±1.77假手術(shù)組 －＊＊

4 討論

冠狀動(dòng)脈左前降支是左心供血的最主要血管，若此血管栓塞使血供急劇減少或中斷，相應(yīng)心肌會(huì)造成嚴(yán)重的損傷。通常在栓塞1 h內(nèi)極易發(fā)生心律失常，最嚴(yán)重可發(fā)生室顫。本研究在贊丹-3湯滴丸藥物干預(yù)下，采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制備急性心肌缺血模型，觀察對(duì)大鼠急性缺血性心律失常發(fā)生的影響。結(jié)果顯示贊丹-3湯滴丸能顯著延遲急性心肌缺血所致心律失常發(fā)生時(shí)間，縮短心律失常持續(xù)時(shí)間，降低室顫發(fā)生率，能有效對(duì)抗急性缺血性心律失常的發(fā)生。

目前有研究表明［3-11］，急性心肌缺血的損傷重要機(jī)制之一是氧自由基產(chǎn)生增加，氧自由基主要是通過產(chǎn)生過氧化反應(yīng)從而影響細(xì)胞代謝，甚至引起細(xì)胞死亡。氧自由基還可以與生物膜上的脂類物質(zhì)反應(yīng)形成多種脂質(zhì)過氧化物，引起膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，使細(xì)胞膜的功能受損，加劇心肌損傷。因此目前應(yīng)用藥物干預(yù)減輕氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損害，成為保護(hù)心肌損傷的重要研究方向。本研究結(jié)果顯示贊丹-3湯滴丸可明顯降低急性心肌缺血大鼠血清中MDA水平和CK活性，提高SOD活性和NO水平，從而抑制了氧自由基的產(chǎn)生，同時(shí)也增強(qiáng)內(nèi)源性氧自由基清除功能，表明可通過提高機(jī)體抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物形成，改善心肌組織的能量代謝，達(dá)到保護(hù)心肌缺血損傷的作用。

有研究表明［12-15］，NF-κB廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞中，在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、重要臟器缺血損傷及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著及其重要的作用，參與冠心病的發(fā)生與發(fā)展。心肌缺血激活的NF-κB有2種形式，p50-p65異二聚體和p50-p50同二聚體。其中p50-p50沒有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，而p50-p65的轉(zhuǎn)錄可激活促炎因子的基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)缺血心肌造成嚴(yán)重的損傷。本研究顯示預(yù)防性給予贊丹-3湯滴丸能明顯降低細(xì)胞NF-κB p65活性表達(dá)，表明抑制NF-κB p65的活性可能是贊丹-3湯滴丸保護(hù)急性心肌缺血損傷的重要機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠缺血心肌進(jìn)行梗死范圍檢測(cè)及病理切片觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化同樣提示預(yù)防性給予贊丹-3湯滴丸能顯著減輕缺血心肌組織結(jié)構(gòu)的損傷程度。

5 結(jié)論

綜上所述，贊丹-3湯滴丸預(yù)防性干預(yù)能使急性心肌缺血組織細(xì)胞損傷明顯減輕，急性缺血性心律失常發(fā)生明顯減少，對(duì)急性心肌缺血損傷具有效的保護(hù)作用。

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