HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒中6種成分

羅友華，楊 輝*，林雪晶，黃愷飛，許光輝，黃亦琦

(1.廈門市醫(yī)藥研究所廈門市天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361008;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122)

復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒是由板藍(lán)根、玄參、桔梗、甘草等六味中藥經(jīng)提取加工制成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、祛痰利咽的功效，用于咽喉腫痛、口咽干燥以及急、慢性咽喉炎和扁桃體炎見(jiàn)以上證候者的治療［1］。該制劑已獲福建省醫(yī)院制劑批準(zhǔn)文號(hào) (閩藥制字Z20120001)，臨床使用療效顯著。

該制劑中，以板藍(lán)根清熱解毒、涼血利咽為君藥，玄參清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)和桔梗宣肺利咽、祛痰排膿共為臣藥，甘草清熱解毒、祛痰止咳為佐使藥。該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅采用了薄層層析定性鑒別，難以有效反映中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量。因此，本實(shí)驗(yàn)分別選擇板藍(lán)根、玄參、桔梗、甘草中的腺苷、(R，S)-告依春、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、甘草苷和甘草酸銨等特征有效成分作為復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒水提液的指標(biāo)成分，建立了HPLC法對(duì)其同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，旨在為及時(shí)檢測(cè)并全面跟蹤有效成分在復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒制備過(guò)程中各工序的轉(zhuǎn)移率提供一種高效方法，同時(shí)也為該中藥復(fù)方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，包括低壓梯度四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，恒溫箱，DAD紫外檢測(cè)器，Chem station色譜工作站 (美國(guó) Agilent公司);XS205電子分析天平 (瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01mg)。

乙腈 (批號(hào) 12100484，色譜純，TEDIA公司)，甲醇 (批號(hào)12090074，色譜純，TEDIA公司)，磷酸 (批號(hào)20130104，分析純，遼寧嘉城精細(xì)化學(xué)品有限公司)，正丁醇 (批號(hào)20081024，廣東光華化學(xué)廠有限公司)，超純水 (自制)。

腺苷 (批號(hào) 110879-200202，純度 100%)、(R，S)-告 依 春 (批 號(hào) 111753-201103，純 度99.5%)、甘草苷 (批號(hào) 111610-201005，純度94.9%)、哈巴俄苷 (批號(hào)111730-201106，純度96.0%)、桔梗皂苷D(批號(hào)111851-201204，純度94.9%)、甘草酸銨 (批號(hào)110731-200614，純度100%)等對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。板藍(lán)根、玄參、桔梗、甘草等藥材均購(gòu)自廈門燕來(lái)福制藥有限公司，經(jīng)本所楊輝副主任藥師鑒定均符合《中國(guó)藥典》2010年版要求。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent Zorbox Eclipse XDB-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脫 (0～10 min，3% ～10%A;10～14 min，10% ～18%A;14～22 min，18% ～24%A;22～30 min，24% ～27%A;30～34 min，27% ～28%A;34～35 min，28% ～33%A;35～40 min，33% ～50%A;40～45 min，50% ～80%A;45～47 min，80% ～100%A;47～48 min，100% ～3%A;48～50 min，3% ～3%A);檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm(0～10 min)、245 nm(10～14 min)、278 nm(14～34.5 min)、210 nm(34.5～35.5 min)、250 nm(35.5～50 min);體積流量1mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量為 10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 分別稱取腺苷2.76 mg、(R，S)-告依春2.56 mg、甘草苷3.84 mg、哈巴俄苷1.08 mg、桔梗皂苷 D 4.34 mg、甘草酸銨8.22 mg置于10 mL的量瓶中，加適量甲醇溶解后，用甲醇定容，搖勻即得混合對(duì)照品溶液，4℃冷藏備用。

2.3 供試品溶液的制備 按復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒處方，稱取板藍(lán)根15 g、玄參5 g、桔梗5 g、甘草2 g等，按復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒最佳提取工藝 (加8倍藥材量的水，微沸提取3次，每次1 h，過(guò)濾后合并濾液即得)得復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒水提液，并濃縮成110 mL，加入甲醇110 mL，搖勻，離心10 min(1200 r/min)，精密量取上清液20 mL，置水浴上蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，將正丁醇液蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至5 mL的量瓶中，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒處方，分別稱取缺板藍(lán)根、缺玄參、缺桔梗、缺甘草的復(fù)方藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備缺板藍(lán)根、缺玄參、缺桔梗、缺甘草的陰性供試品溶液，4℃冷藏備用。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性試驗(yàn) 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，所測(cè)6種有效成分與其他成分色譜峰均可基線分離(分離度大于1.5)，且陰性供試品無(wú)干擾。對(duì)照品、供試品及陰性供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

3.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液67、100、200、500、1000、1667、3333、5000 μL分別置5 mL的量瓶中，加甲醇定容后搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件紀(jì)錄色譜圖及峰面積。以峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo)，得回歸方程:腺苷y=12325x+24.11，r=0.9996;(R，S)-告依春y=67935x+154.08，r=0.9991;甘草苷y=15633x+48.40，r=0.9992;哈巴俄苷y=27735x+25.78，r=0.9991;桔梗皂苷 D y=1558.5 x+14.66，r=0.9991;甘草酸銨y=7283.5x+52.84，r=0.9991。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨分別在 0.0037～0.2760、0.0034～0.2547、0.0049～0.3644、0.0014～0.1037、0.0055～0.4119和0.0110～0.8220 mg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

3.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨峰面積的 RSD值分別為1.0%、1.0%、1.0%、1.0%、1.0%和1.0%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨峰面積的RSD值分別為0.9%、0.8%、0.1%、1.0%、1.7%、0.1%。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào) (批號(hào)20130401)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12 h測(cè)定。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨峰面積的RSD值分別為 1.4%、0.7%、0.4%、0.2%、1.8%和0.2%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取5000 μL已知含有量的復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒水提液濃縮液 (批號(hào)20130301，各成分質(zhì)量濃度分別為:腺苷0.0624 mg/mL，(R，S)-告依春 0.0450 mg/mL，甘草苷0.0888 mg/mL，哈巴俄苷0.0227 mg/mL，桔梗皂D 0.0553 mg/mL，甘草酸銨0.1083 mg/mL)5份，分別精密加入已知質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液［腺苷 0.0610 mg/mL，(R，S)-告依春 0.0421 mg/mL，甘草苷0.0844 mg/mL，哈巴俄苷0.0243 mg/mL，桔梗皂苷 D 0.0560 mg/mL，甘草酸銨0.1043 mg/mL］ 5000 μL，加入甲醇 10 mL，搖勻，離心10 min(1200 r/min)，小心取出上清液，置水浴上蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，將正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移并定容至5 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，然后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.7 樣品測(cè)定 取3批藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法提取制備，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

4.1 現(xiàn)代研究表明，板藍(lán)根主要含有生物堿類、有機(jī)酸類、多糖類、氨基酸類、核苷類等，其中腺苷等核苷類和表告依春等生物堿類均是其抗病毒的重要有效成分［2-4］;玄參主要含環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類，其中哈巴俄苷為玄參特征性有效成分，具有抗炎等作用［5-7］;桔梗主要有效成分為三萜皂苷類，桔梗皂苷D是其主要皂苷，具有祛痰作用［8］;甘草主要活性成分為甘草苷等甘草黃酮類和甘草酸等甘草皂苷類，具有抗炎、抗病毒、祛痰等活性［9］。這6種有效成分與復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒的功效主治密切相關(guān)，故選擇這6種成分進(jìn)行測(cè)定。

4.2 在190～400 nm間分別對(duì)腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸銨溶液做紫外掃描，發(fā)現(xiàn)其分別在260、245、278、278、210、250 nm處有最大吸收，結(jié)合《中國(guó)藥典》2010年版相關(guān)藥材項(xiàng)下成分測(cè)定方法，根據(jù)這6種成分的保留時(shí)間，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)切換時(shí)間順序?yàn)?60 nm(0～10 min)、245 nm(10～14 min)、278 nm(14～34.5 min)、210 nm(34.5～35.5 min)、250 nm(35.5～50 min)。

4.3 在預(yù)試驗(yàn)中考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液等流動(dòng)相，最終選擇乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相，按本實(shí)驗(yàn)梯度洗脫程序，結(jié)果除桔梗皂苷D的色譜峰未基線分開(kāi)外，其余各有效成分色譜峰均較好分開(kāi)，保留時(shí)間也適中。又因桔梗皂苷D的響應(yīng)值較低，易受其他雜質(zhì)影響。所以，對(duì)復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒水提液按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，最終使桔梗皂苷D分離良好。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of content determination of samples(n=3)

4.4 中藥成分的多樣性、復(fù)雜性和作用機(jī)制的模糊性使中藥質(zhì)量控制仍存在許多問(wèn)題，是中藥現(xiàn)代化的瓶頸之一，中藥的整體作用及多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，決定了任何一個(gè)單一成分作為指標(biāo)都不能準(zhǔn)確反映中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量［10］。應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)方有效成分群的多指標(biāo)成分檢測(cè)，是中藥質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢(shì)［11-15］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的同時(shí)測(cè)定復(fù)方板藍(lán)根利咽顆粒水提液中6種有效成分的HPLC法，為其今后生產(chǎn)質(zhì)量控制研究提供了依據(jù)。

［1］羅友華，楊 輝，黃亦琦，等.咽舒寧顆粒祛痰鎮(zhèn)痛及抑菌作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(1):287-290.

［2］方建國(guó)，湯 杰，楊占秋，等.板藍(lán)根體外抗單純皰疹病毒Ⅰ型作用［J］.中草藥，2005，36(2):242-244.

［3］徐麗華，黃 芳，陳 婷，等.板藍(lán)根中的抗病毒活性成分［J］.中國(guó)天然藥物，2005，3(6):359-360.

［4］陳 凱，竇 月，陳 智，等.板藍(lán)根抗病毒與抗內(nèi)毒素等清熱解毒藥效作用及化學(xué)基礎(chǔ)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(18):275-278.

［5］胡瑛瑛，黃 真.玄參的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32(2):268-270.

［6］謝麗華，劉洪宇，錢瑞琴，等.哈巴苷與哈巴俄苷對(duì)陰虛小鼠免疫功能及血漿環(huán)化核苷酸的影響［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2001，33(3):283-284.

［7］張建春，朱建美.玄參的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥工業(yè)，2003，22(1):25-27.

［8］李 婷，徐文珊，李西文，等.中藥桔梗的現(xiàn)代藥理研究進(jìn)展［J］.中藥藥理與臨床，2013，29(2):205-208.

［9］高雪巖，王文全，魏勝利，等.甘草及其活性成分的藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34(21):2695-2700.

［10］陸兔林，石上梅，蔡寶昌，等.基于一測(cè)多評(píng)的中藥多成分定量研究進(jìn)展［J］.中草藥，2012，43(12):2525-2529.

［11］賀福元，鄧凱文，石繼連，等.中藥有效成分群組方技術(shù)研究若干基礎(chǔ)瓶頸問(wèn)題及數(shù)理特征化思路的提出［J］.中藥材，2009，32(1):1-7.

［12］尤春雪，張振秋，侯學(xué)智，等.HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)同時(shí)測(cè)定升麻、葛根藥對(duì)提取物中11個(gè)成分［J］.中成藥，2013，35(4):761-765.

［13］閆高穎，董娟妮，楊 洋，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定心腦康膠囊中6種成分［J］.中成藥，2013，35(4):1672-1675.

［14］趙 超，李會(huì)軍，陳 君，等.中藥復(fù)雜成分解析與質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43(3):283-288.

［15］周 蓬，宋 青，馬 帥.HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒鼓翹清熱顆粒中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素［J］.中成藥，2013，35(8):1693-1696.