淫藤骨痹康方中7種活性成分的大孔樹脂靜態(tài)吸附性能研究

王元清，羅 堃，李順祥*，嚴(yán)建業(yè)*，黃 丹，徐 菲

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410208;2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)與工程實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410004)

淫藤骨痹康方為治療骨關(guān)節(jié)炎的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由淫羊藿、白芍、丹參、枳殼、當(dāng)歸等十味中藥組成，具有行氣活血、通絡(luò)祛痹、益腎壯骨的功效，用于治療氣血瘀滯、肝腎虧損型骨關(guān)節(jié)炎，其臨床療效顯著。

骨痹康方中水溶性成分淫羊藿苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用［1-3］;阿魏酸能夠有效地抑制血小板的聚集［4］;原兒茶醛具有明顯改善微循環(huán)的作用［5］。大孔吸附樹脂的吸附分離方法已廣泛應(yīng)用于中藥及中藥復(fù)方的純化研究中［6-7］，本研究考察7種活性成分的大孔樹脂靜態(tài)吸附性能，為淫藤骨痹康方活性成分在大孔樹脂上的動(dòng)態(tài)吸附的分離純化工藝奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司);電子分析天平T-214(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精弘實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海精弘實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥 原兒茶醛對(duì)照品 (供含量測(cè)定用，批號(hào)110605)、橙皮苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)110721)均由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供;阿魏酸對(duì)照品 (供含量測(cè)定用，批號(hào)110773-200611)、芍藥苷對(duì)照品 (供含量測(cè)定用，批號(hào)110736-200934)、柚皮苷對(duì)照品 (供含量測(cè)定用，批號(hào)110722-200610)、淫羊藿苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)110737-200415)均由中國食品藥品檢定研究院提供;新橙皮苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)111610-200604)由南昌貝塔生物科技有限公司提供;所有藥材均購自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，并按《中國藥典》2010年版要求檢測(cè)，均符合規(guī)定。樹脂AB-8、D101、NKA-9、DM130、HPD100(河北滄州寶恩化工有限公司);乙腈(色譜純，美國Tedia試劑公司);水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多成分的HPLC法測(cè)定

2.1.1 色譜條件 大連伊利特ODS2 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈 (A)-0.1%磷酸水溶液 (B)為流動(dòng)相梯度洗脫 (0～8 min，15%～19%A;8～12 min，19% ～20%A;12～16 min，20% ～21%A;16～25 min，21% ～26%A;25～26 min，26% ～30%A;26～40 min，30% ～30%A;40～42 min，30% ～15%A);波長變化為316 nm→230 nm→283 nm→270 nm→316 nm(0→13→15→30→45 min)。體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃。對(duì)照品及樣品的色譜圖見圖1。

圖1 淫藤骨痹康方的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of Yinteng Gubikang Formula

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取原兒茶醛、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，分別加甲醇制成20、40.8、23.6、43、25、106、18.4 μg/mL的對(duì)照品溶液，從中各精密移取1.0 mL對(duì)照品溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將大孔樹脂吸附后的上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 樣品的測(cè)定 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液15 μL、樣品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算。

2.2 大孔吸附樹脂預(yù)處理 以95%乙醇浸泡樹脂24 h，充分溶脹后濕法裝柱，用95%乙醇通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色渾濁，并在200～400 nm處掃描沒有紫外吸收，再用蒸餾水洗至沒有醇味，抽濾至干，備用。

2.3 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附性能的研究

2.3.1 樣品溶液的制備 稱取淫藤骨痹康方水提浸膏，加水溶解，配制成實(shí)驗(yàn)用所需濃度的樣品溶液。

2.3.2 不同型號(hào)樹脂的篩選 稱取2.0 g抽濾至干 的 濕 樹 脂 AB-8、D101、NKA-9、DM130、HPD100分別置于具塞錐形瓶中，各加入骨痹康方樣品溶液20 mL(生藥質(zhì)量濃度0.8 g/mL)，將錐形瓶置于恒溫水浴箱鍋中，并定時(shí)振搖，24 h后測(cè)定上清液中各成分的量，計(jì)算各樹脂的吸附量。取上述吸附飽和的各樹脂，先用50 mL水淋洗表面溶液，再分別加入100 mL 70%乙醇，定時(shí)振搖，24 h后，抽濾，測(cè)定濾液中各成分的量，計(jì)算各樹脂對(duì)各成分的吸附量與解吸率。結(jié)果見表1～3。采用Topsis綜合評(píng)價(jià)法評(píng)價(jià)各樹脂對(duì)7種成分的吸附量×解吸附率，優(yōu)選最佳樹脂，分析結(jié)果見表4～5。

由表1可知，不同成分在同一樹脂上的吸附量不同，同一成分在不同樹脂上的吸附量也不同，都存在較大的差異;由表2可知，不同成分在同一樹脂上的解吸率不同，同一成分在不同樹脂上的解吸率也不同，都存在較大的差異;由表5可知，五種樹脂對(duì)7種成分的綜合吸附-解吸附性能為HPD100﹥NKA-9﹥D101﹥AB-8﹥DM130。

表1 5種大孔樹脂對(duì)淫藤骨痹康方中7種成分的靜態(tài)吸附量Tab.1 Static absorption of seven components from Yinteng Gubikang Formula on five macroporous resins

表2 5種大孔樹脂對(duì)淫藤骨痹康方中7種成分的靜態(tài)解吸附率Tab.2 Static desorption of seven components from Yinteng Gubikang Formula on five macroporous resins

表3 5種大孔樹脂對(duì)淫藤骨痹康方中7種成分的綜合吸附-解吸附性能Tab.3 Comprehensive absorption and desorption capability of seven components from Yinteng Gubikang Formula on five macroporous resins

表4 5種大孔樹脂對(duì)淫藤骨痹康方中7種成分的綜合吸附-解吸附性能的變換陣距Tab.4 Transformation matrix of the comprehensive absorption and desorption capability of seven components from Yinteng Gubikang Formula on five macroporous resins

表5 不同樹脂的排序指標(biāo)值Tab.5 Scheduling index value of different resins

2.3.3 pH的考察 稱取已處理好的HPD100大孔樹脂6份，每份2.0 g，分別置于6個(gè)具塞錐形瓶中，加入樣品溶液20 mL(生藥質(zhì)量濃度0.8 g/mL)，一份不調(diào)pH，其他5份分別調(diào)節(jié)pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將錐形瓶置于恒溫水浴箱鍋中，定時(shí)震搖，24 h后測(cè)定上清液中各成分量，計(jì)算樹脂的吸附量。結(jié)果見表6。采用Topsis綜合評(píng)價(jià)法評(píng)價(jià)不同pH下對(duì)7種成分的吸附量，優(yōu)選最佳pH，結(jié)果見表7、表8。

表6 pH對(duì)淫藤骨痹康方中7種成分靜態(tài)吸附性能的影響Tab.6 Effects of pH values on the static adsorption of macroporous resins

表8 不同pH值樣品的排序指標(biāo)值Tab.8 Scheduling index value of samples with different pH values

由表8可知，將樣品溶液調(diào)節(jié)pH值為5.0時(shí)，HPD100大孔樹脂對(duì)7種成分的綜合吸附性能較好，因而可將pH值調(diào)節(jié)為5.0。

2.3.4 樣品質(zhì)量濃度的考察 稱取已處理好的HPD100大孔樹脂4份，每份2.0 g，分別置于4個(gè)具塞錐形瓶中，分別加入一定濃度樣品溶液，樣品溶液的生藥質(zhì)量濃度為0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL。將錐形瓶置于恒溫水浴箱鍋中，定時(shí)振搖，24 h后測(cè)定上清液中各成分量，計(jì)算樹脂的吸附量。結(jié)果見表9。采用Topsis綜合評(píng)價(jià)法評(píng)價(jià)HPD100大孔樹脂對(duì)不同質(zhì)量濃度樣品中7種成分的吸附量，優(yōu)選最佳樣品濃度，結(jié)果見表10、表11。

表9 樣品質(zhì)量濃度對(duì)淫藤骨痹康方中7種成分靜態(tài)吸附性能的影響Tab.9 Effects of sample concentration on the static absorption of macroporous resins

表10 樣品質(zhì)量濃度對(duì)淫藤骨痹康方中7種成分靜態(tài)吸附性能的變換陣距Tab.10 Transformation matrix of the effects of sample concentration on the static absorption of macroporous resins

表11 不同質(zhì)量濃度樣品的排序指標(biāo)值Tab.11 Scheduling index value of samples with different concentrations

由表11可知，當(dāng)樣品溶液的生藥質(zhì)量濃度為0.6 g/mL時(shí)，HPD100大孔樹脂對(duì)7種成分的綜合吸附性能較好，因而可將樣品溶液生藥質(zhì)量濃度定為0.6 g/mL。

2.3.5 靜態(tài)吸附曲線的考察 稱取2.0 g HPD100大孔樹脂裝于具塞錐形瓶中，加入60 mL生藥質(zhì)量濃度為0.6 g/mL的樣品溶液，將錐形瓶置于恒溫水浴箱鍋中，定時(shí)振搖，分別于15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h取樣，測(cè)定7種成分的吸附量，結(jié)果見圖2、表12。

由圖2可知，方中所考察的成分在1～2 h達(dá)到靜態(tài)平衡;由表12可知，樣品的靜態(tài)吸附過程在24 h內(nèi)吸附量與時(shí)間的關(guān)系可用相關(guān)的數(shù)學(xué)方程擬合，P值均小于0.05，表明方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同成分在HPD100大孔樹脂上的靜態(tài)吸附曲線Fig.2 Static absorption curves of the different components on macroporous resins

表12 淫藤骨痹康方中7種成分在HPD100大孔樹脂上的靜態(tài)吸附量-時(shí)間的數(shù)學(xué)方程擬合Tab.12 Mathematical equation of static absorption-time of different components

3 討論

3.1 多成分的定量測(cè)定中，在文獻(xiàn) ［8］的基礎(chǔ)上反復(fù)摸索，考察了色譜柱、流動(dòng)相、波長等。色譜柱考察了 Diamonsil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)、大連伊利特 ODS2 C18色譜柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)、NUCLEOSIL C18色譜 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)等，發(fā)現(xiàn)大連伊利特ODS2 C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)的柱效較高，分離性能較好。流動(dòng)相分別考察了乙腈-醋酸水、乙腈-磷酸水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-醋酸水、甲醇-磷酸水等系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸水系統(tǒng)的洗脫條件較好，并在梯度洗脫條件下可將樣品中的7個(gè)活性成分較好地分離，基線平穩(wěn)。波長選擇中，考察了230、283、316 nm等，發(fā)現(xiàn)在可變波長條件下，樣品中各成分的吸收峰較大，因而選擇可變波長。通過此條件的摸索，優(yōu)化了淫藤骨痹康方中7種活性成分的HPLC分離測(cè)定條件，該定量測(cè)定方法已進(jìn)行方法學(xué)考察確證，將另文發(fā)表。

3.2 綜合評(píng)價(jià)是利用數(shù)學(xué)方法 (包括數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法)對(duì)一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)的多個(gè)指標(biāo)信息進(jìn)行加工和提煉，以求得其優(yōu)劣等級(jí)的一種評(píng)價(jià)方法，主要方法有:層次分析加權(quán)法、相對(duì)差距和法、主成分分析法、Topsis法、秩和比法、全概率評(píng)分法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、因子分析法等［9］。其中Topsis法已應(yīng)用于中藥質(zhì)量的研究中［10-11］，其原理為在歸一化后的原始矩陣中，找出有限方案中最優(yōu)方案與最劣方案 (分別用最優(yōu)向量與最劣向量表示)，然后計(jì)算出評(píng)價(jià)對(duì)象與最優(yōu)方案和最劣方案間的距離，獲得該評(píng)價(jià)對(duì)象與最優(yōu)方案的相對(duì)接近程度，并作為評(píng)價(jià)優(yōu)劣的依據(jù)。其基本模型為:Ci=Di－/(Di++Di－)其中:Di－為評(píng)價(jià)方案到最劣方案間的距離。Di+為評(píng)價(jià)方案到最優(yōu)方案間的距離。Ci為樣本點(diǎn)到最優(yōu)樣本點(diǎn)的相對(duì)接近度。Ci接近于l時(shí)，評(píng)價(jià)方案越接近于最優(yōu)方案。本實(shí)驗(yàn)采用Topsis法綜合評(píng)價(jià)中藥復(fù)方多指標(biāo)的大孔樹脂靜態(tài)吸附脫吸附工藝，獲得了滿意的結(jié)果。

3.3 淫藤骨痹康方是由十味中藥組成的大復(fù)方，預(yù)實(shí)驗(yàn)研究表明，該方的水提液的浸膏得率較高，因而需進(jìn)一步純化。目前大孔樹脂在中藥復(fù)方活性成分富集中的應(yīng)用也日漸增多，它具有吸附容量大，解吸附率高，樹脂可以簡單再生等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹脂靜態(tài)吸附該方的水溶性活性成分，旨在進(jìn)一步為動(dòng)態(tài)吸附工藝研究提供基礎(chǔ)。不同pH條件下，綜合吸附量存在較大差異，這與骨痹康方中的多種成分的競(jìng)爭性吸附有關(guān)，在吸附過程中，pH的改變，使水溶性成分所存在的體系得以改變，從而改變了成分的解離性能，這樣就改變了樣品的吸附性能。靜態(tài)吸附曲線考察中，樹脂對(duì)7種成分的飽和吸附量不同，除了與成分本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)外，還與成分初始濃度有關(guān)，初始濃度大，相對(duì)的吸附量要高。在靜態(tài)吸附研究中發(fā)現(xiàn)，不同成分在同一樹脂上的吸附量與解吸附率不同，同一成分在不同樹脂上的吸附量與解吸附率也不同，都存在較大的差異。研究表明HPD100對(duì)7種成分的綜合吸附-解吸附性能優(yōu)于其他樹脂，可用于淫藤骨痹康方的純化研究中。

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