淡竹葉提取液對(duì)酪氨酸酶抑制作用研究△

齊美娜，林冰，楊航，祁燈響，周禮青

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 中藥天然藥研發(fā)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

中藥工業(yè)

貴州省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合計(jì)Z字[2010]4015)；貴州省高校工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目(黔教合KY字[2012]018號(hào))；貴州大學(xué)大學(xué)生“SRT計(jì)劃”項(xiàng)目[貴大SRT字(2012)68號(hào)]

*

林冰，副教授，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及中藥材開(kāi)發(fā)利用；E-mail：362570847@qq.com

淡竹葉提取液對(duì)酪氨酸酶抑制作用研究△

齊美娜1*，林冰1，2，3*，楊航1，祁燈響1，周禮青1

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 中藥天然藥研發(fā)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

目的研究淡竹葉提取液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，并以此優(yōu)選提取工藝。方法以酪氨酸酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)超聲提取淡竹葉的工藝進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果淡竹葉的最佳提取工藝條件是60%的乙醇，超聲功率為90 W，超聲提取50 min。此條件下提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率可達(dá)78.0%，IC50值為6.27 g·L-1。結(jié)論淡竹葉提取液來(lái)源廣泛，提取方便，經(jīng)濟(jì)有效，可為開(kāi)發(fā)植物源酪氨酸酶抑制劑提供一種新的選擇。

淡竹葉提取液；酪氨酸酶；抑制效果；正交試驗(yàn)

淡竹葉LophatherumgracileBrongn.為禾本科多年生草本植物，廣泛分布于江蘇、浙江、江西、廣西、湖南、福建等地，并且在許多地區(qū)均有栽培，資源十分豐富[1]。酪氨酸酶(tyrosinase)是體內(nèi)合成黑色素的關(guān)鍵酶，它有兩個(gè)主要功能：一是作為單酚酶，羥基化單酚生成鄰二酚；二是作為雙酚酶，氧化鄰二酚生成鄰醌[2]，鄰醌再經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜反應(yīng)生成黑色素[3]。酪氨酸酶抑制劑可以抑制黑色素生成，在化妝品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，此外，在醫(yī)藥、食品及農(nóng)業(yè)抗蟲(chóng)領(lǐng)域也有應(yīng)用[4]。已有研究表明黃酮類(lèi)化合物均對(duì)酪氨酸酶有一定的抑制作用[5]，而淡竹葉中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物[1]。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)淡竹葉提取物的研究多集中于抗氧化、抗炎、抗腫瘤等方面，對(duì)于其對(duì)酪氨酸酶的抑制鮮有報(bào)道。本文選取鄰苯二酚為底物，測(cè)定淡竹葉提取液對(duì)雙酚酶的抑制作用，以酪氨酸抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)的方法，對(duì)淡竹葉超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計(jì)(UV-1801，北京北分瑞利分析儀器)；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(DGG-9246A型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-18M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；手持式高速均質(zhì)機(jī)(FJ150，上海標(biāo)本模型廠(chǎng))；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；電子天平(莆田市亞太計(jì)量?jī)x器有限公司，顯示分度值：0.001 g)；萬(wàn)能粉碎機(jī)(FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司)，超聲波儀(KH-500DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，移液槍(Tegen Beta，100～1 000 μL)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HB-8，上海梅香儀器有限公司)。

淡竹葉鮮品采收于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.；新鮮土豆購(gòu)于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)；鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純；蒸餾水。

2 方法

2.1 材料預(yù)處理

新鮮土豆保存于4 ℃冰箱中，于使用前去皮洗凈切碎。淡竹葉鮮品切成小段于干燥箱中干燥至含水率約為10%，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)二號(hào)篩備用。

2.2 酪氨酸酶溶液的制備

取處理好的土豆樣品25 g置于100 mL的燒杯中，加入0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)50 mL，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2～3 min，再用6層紗布過(guò)濾，濾液用冷凍離心機(jī)離心5 min，取上清液備用[6]，以下簡(jiǎn)稱(chēng)酶液。

2.3 酪氨酸酶溶液最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定

于試管中依次精密加入0.1 mL酶液、0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)2 mL，0.025 mol·L-1的鄰苯二酚溶液(用pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液配置)1 mL。25 ℃孵育5 min后，迅速放入分光光度計(jì)中，在360～500 nm進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)λmax=408 nm[7]。

2.4 酪氨酸酶活性的測(cè)定

精密量取0.1 mL酶液，0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)2 mL于試管中，25 ℃孵育10 min，再加入0.025 mol·L-1的鄰苯二酚溶液1 mL，搖勻，迅速放入分光光度計(jì)中，以0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)為參比，在λmax處進(jìn)行時(shí)間掃描，時(shí)間范圍0～300 s，掃描間隔為10 s，得到酶促反應(yīng)的時(shí)間曲線(xiàn)，取0～80 s曲線(xiàn)的斜率計(jì)算酶活力[7]，調(diào)節(jié)酶液濃度，使每次實(shí)驗(yàn)酶活力值相同。

2.5 淡竹葉提取物對(duì)酪氨酸酶抑制率的測(cè)定

分別在4支試管中精密加入酶液、0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)、蒸餾水及淡竹葉提取液，各溶液的加入量見(jiàn)表1。將4支試管在25 ℃孵育10 min后，分別加入0.025 mol·L-1的鄰苯二酚溶液1 mL，繼續(xù)在25 ℃孵育4 min，然后立即于λmax處測(cè)量其吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算酪氨酸酶抑制率I。

I=[(Aa-Ab)-(Ac-Ad)]/(Aa-Ab)×100%

表1 酪氨酸酶抑制率實(shí)驗(yàn)中各種溶液的加入量 /mL

2.6 單因素試驗(yàn)

取粉碎過(guò)篩后的淡竹葉2.5 g，置于具塞錐形瓶中，分別采用超聲時(shí)間(20，40，60，80 min)，料液比(1∶20，1∶40，1∶60)，超聲功率(40，60，80，100 W)，乙醇濃度(50%，70%，90%)對(duì)淡竹葉進(jìn)行提取，提取液抽濾，濃縮至無(wú)醇味，抽濾，定容至250 mL，相當(dāng)于1 L溶液中含藥材10 g。按2.5項(xiàng)下進(jìn)行酪氨酸酶抑制率測(cè)定。

2.7 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酪氨酸酶抑制率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)淡竹葉提取液的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)

照2.7項(xiàng)下篩選出的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，照2.5項(xiàng)下的方法測(cè)定其酪氨酸酶抑制率，重復(fù)3次。同時(shí)，分別用1，3，5，7 g·L-1的維生素C(抗壞血酸)溶液代替提取液，照2.5項(xiàng)下的方法測(cè)定其酪氨酸酶抑制率。

2.9 不同濃度淡竹葉提取液對(duì)酪氨酸酶抑制作用的考察

照2.7項(xiàng)下篩選出的最佳提取工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將得到的淡竹葉提取液稀釋定容，配制成1 L分別含藥材2.5，5.0，7.5，10.0 g的溶液，照2.5項(xiàng)下的方法測(cè)定其酪氨酸酶抑制率，并求算IC50值。

3 結(jié)果

3.1 酪氨酸酶活性的測(cè)定結(jié)果

酪氨酸酶酶促反應(yīng)的時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。可以看出，酪氨酸酶溶液的吸光度在0～80 s與時(shí)間之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。若定義在該反應(yīng)體系內(nèi)以每分鐘變化0.01A為一個(gè)活力單位(U)[3]，計(jì)算得出酶活力為12.9 U·min-1，表明該酶液有一定的酪氨酸酶活性，可以用于實(shí)驗(yàn)。

圖1 酪氨酸酶酶促反應(yīng)的時(shí)間曲線(xiàn)

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 超聲時(shí)間對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響 超聲時(shí)間為20，40，60，80 min時(shí)，酪氨酸酶抑制率分別為41.7%，67.0%，54.8%，49.6%，故最佳超聲時(shí)間為40 min。

3.2.2 料液比對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響 料液比為1∶20，1∶40，1∶60時(shí)，酪氨酸酶抑制率分別為66.7%，67.1%，71.4%，由于抑制率相差不大，考慮到抽濾時(shí)料液比為1∶20時(shí)溶劑殘留、1∶60時(shí)溶劑用量過(guò)大等問(wèn)題，選取1∶40為最佳料液比。

3.2.3 超聲功率對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響 超聲功率為40，60，80，100 W時(shí)，酪氨酸酶抑制率分別為65.1%，68.0%，74.0%，73.2%，故最佳超聲功率應(yīng)選擇80 W。

3.2.4 乙醇濃度對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響 乙醇濃度為50%，70%，90%時(shí)，酪氨酸酶抑制率分別為66.5%，76.8%，52.1%，故最佳乙醇濃度為70%。

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，與其他因素相比，料液比對(duì)酪氨酸酶抑制率影響較小，故以超聲時(shí)間、超聲功率及乙醇濃度3個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 淡竹葉超聲提取正交試驗(yàn)因素水平表

表3 淡竹葉超聲提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3極差數(shù)據(jù)可知，對(duì)提取物中酪氨酸酶抑制率影響的主次順序?yàn)锽>C>A，最佳提取條件為A3B3C1，即超聲50 min，超聲功率90 W，乙醇濃度60%。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的酪氨酸酶抑制率結(jié)果分別為78.0%，77.1%，77.7%，平均值為77.6%，高于正交試驗(yàn)中各項(xiàng)結(jié)果，因此確定A3B3C1為最佳提取條件。陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中3 g·L-1的維生素C溶液對(duì)酪氨酸酶的抑制率為74.3%，與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中淡竹葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率相當(dāng)。

3.5 不同質(zhì)量濃度的淡竹葉提取液對(duì)酪氨酸酶的抑制結(jié)果

由圖2可以看出，對(duì)酪氨酸酶的抑制效果，隨淡竹葉提取液質(zhì)量濃度的增大而線(xiàn)性增加，由圖可計(jì)算得到IC50值為6.27 g·L-1。

圖2 不同質(zhì)量濃度的淡竹葉提取液對(duì)酪氨酸酶的抑制結(jié)果

4 討論

酪氨酸酶抑制劑在化妝品、醫(yī)藥、食品及農(nóng)業(yè)抗蟲(chóng)等方面均有廣泛應(yīng)用，近年來(lái)從天然植物中尋找安全高效的酪氨酸酶抑制劑越來(lái)越受到人們的重視。本文以酪氨酸酶抑制率為指標(biāo)，對(duì)中藥淡竹葉的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，得到其最佳提取條件為60%乙醇，超聲功率為90 W，超聲50 min。在此條件下，10 g·L-1的淡竹葉提取液對(duì)酪氨酸酶抑制率可達(dá)到78%。與3 g·L-1的維生素C溶液對(duì)酪氨酸酶的抑制效果相當(dāng)，說(shuō)明淡竹葉提取液具有較好的酪氨酸酶抑制能力。

酪氨酸酶是人體合成黑色素的關(guān)鍵酶，適當(dāng)抑制酪氨酸酶活性可實(shí)現(xiàn)健康美白。淡竹葉提取液對(duì)酪氨酸酶的抑制效果在0～10 g·L-1隨質(zhì)量濃度的增加而線(xiàn)性增強(qiáng)，因此可通過(guò)調(diào)節(jié)提取液濃度，得到相應(yīng)的抑制效果。淡竹葉提取液來(lái)源廣泛，提取簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)有效，可為開(kāi)發(fā)植物源酪氨酸酶抑制劑提供選擇。

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InhibitionEffectofLophatherumgracileBrongnExtractsonTyrosinase

QIMeina1*，LINBing1，2，3*，YANGHang1，QIDengxiang1,ZHOULiqing1

(1.PharmacyDepartment，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.EngineeringCenterforInnovativeTraditionalChineseMedicineandEthnicMedicineofGuizhouProvince，Guiyang550025，China；3.ResearchandDevelopmentCenterofTraditionalChineseMedicinalandNaturalProducts，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China)

Objective：The inhibitory activity of theLophatherumgracileBrongn extracts against tyrosinase was investigated in the present work.MethodsThe extract technology ofL.gracilewas optimized by orthogonal experiment.The inhibitory activity of the extracts against tyrosinase was used as evaluating criterion.ResultsThe optimum extraction conditions were obtained as follows：ultrasonic power 90W，solvent of 60% ethanol and extracting 20 min.Under these conditions，the inhibition on effect of the extract obtained from extraction(containing 10 g·L-1)achieves inhibiti on rate of 78% and IC50of 6.27 g·L-1.ConclusionBecause of the wide source and high quality in effective extraction, it can provide a new reference for resource development ofL.gracile.

LophatherumgracileBrongn extract；tyrosinase；inhibitory action；orthogonal experiment

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.014

2013-11-17)