婦科千金片對(duì)慢性盆腔炎模型大鼠卵巢組織caspase－3和caspase－8表達(dá)的影響

聶 晶，李 鑫，2，師振予，3＊，郭建生，3（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 40208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，長(zhǎng)沙 40007；3.國(guó)家中藥學(xué)藥管局中藥藥性與藥效實(shí)驗(yàn)室三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 40208）

婦科千金片由千斤拔、金櫻根 、當(dāng)歸、黨參、雞血藤、穿心蓮、單面針、功勞木等八味中藥組成，具有清熱解毒、活血化瘀、補(bǔ)氣養(yǎng)血之功效。該藥在臨床已廣泛使用，對(duì)于濕熱下注、兼氣血不足引起的急慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎等婦科常見(jiàn)病具有顯著療效［1－2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，婦科千金片對(duì)急性盆腔炎大鼠的免疫球蛋白具有調(diào)節(jié)作用，可提高機(jī)體免疫能力［3］，對(duì)大鼠子宮、卵巢、輸卵管等盆腔組織起到保護(hù)作用［4］，還可以通過(guò)降低大鼠子宮、卵巢組織 NF－κB蛋白、IL－6mRNA，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)發(fā)揮抗炎免疫作用［5－6］。本研究擬觀察婦科千金片對(duì)大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspase－3和caspase－8蛋白表達(dá)的影響，從細(xì)胞凋亡角度探討和完善其治療慢性盆腔炎的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Shandon325型石蠟切片機(jī)（英國(guó)Shandon公司）；JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）。

1.2 試藥 婦科千金片（株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20110901）；婦炎康片（湖南湘泉制藥有限公司，批 號(hào) 111105）；caspase－3 免 疫 組 化 試 劑 盒、caspase－8免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限 公 司）；大 腸 桿 菌 （Escherichia coli，菌 種 號(hào)26002），金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，菌種號(hào)44152），解脲脲原體（M.urealyticum，菌種號(hào)52011），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)免疫與微生物教研室伍參榮教授惠贈(zèng)。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠（長(zhǎng)沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào) SCXK（湘）2009－0004），雌性，SPF級(jí)，體質(zhì)量200±20g。

2 方法

2.1 建立慢性盆腔炎模型 參考文獻(xiàn)方法［7－8］，用注射器分別抽取等體積的濃度為1×109cfu的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和解脲脲原體菌液，注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，混合均勻。將醫(yī)用明膠片剪成0.5cm×0.5cm的方塊，置于混合菌液中，使其充分接觸。明膠充分飽和后，左手持鼠尾，將大鼠倒立，右手夾含混合菌液的明膠塊經(jīng)陰道塞至宮腔內(nèi)，左右各1塊，并保持大鼠倒立1～2min。隔天1次，連續(xù)4次。假手術(shù)組塞入不含菌液的明膠塊。

2.2 分組及給藥 將成功建立的模型組大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，每組10只。婦科千金片組高、中、低劑量分別按2.08，1.04和0.52g·kg－1ig給予相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液，婦炎康組按0.41g·kg－1給予婦炎康藥液，空白對(duì)照組、假手術(shù)組及模型組分別給予等容積蒸餾水，ig給藥，1次·d－1，連續(xù)21d。

2.3 大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織中caspase－3和caspase－8表達(dá)情況測(cè)定 解剖大鼠，取大鼠卵巢組織，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢組織caspase－3和caspase－8表達(dá)情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)均以±s表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布，采用單因素方差分析；呈非正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)（P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

3 結(jié)果

3.1 婦科千金片對(duì)大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspase－3表達(dá)情況 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織caspase－3蛋白表達(dá)有非常顯著性差異（P＜0.01）。經(jīng)婦科千金片治療后，與模型組相比，婦科千金片低劑量caspase－3蛋白有顯著性升高（P＜0.05），婦科千金片中、高劑量組caspase－3蛋白的表達(dá)也有非常顯著性升高（P＜0.01）。見(jiàn)表1和圖1。

3.2 婦科千金片對(duì)大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspase－8表達(dá)情況 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織caspase－8蛋白表達(dá)有非常顯著性差異（P＜0.01）。經(jīng)婦科千金片治療后，與模型組相比，婦科千金片低、中、高劑量組caspase－8蛋白的表達(dá)有非常顯著性升高（P＜0.01）。見(jiàn)表1和圖2。

表1 婦科千金片對(duì)caspase－3和caspase－8蛋白光密度的影響Tab.1 The influence of Fuke Qianjin Tablets to caspase－3and caspase－8expression（±s，n＝10）

表1 婦科千金片對(duì)caspase－3和caspase－8蛋白光密度的影響Tab.1 The influence of Fuke Qianjin Tablets to caspase－3and caspase－8expression（±s，n＝10）

注：與空白組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組相比★P＜0.05，★★P＜0.01

組別 劑量／g·kg－1 caspase－8 AOD空白組 － 17.60±2.76★★15.40±3.75 caspase－3 AOD★★25.50±2.83假手術(shù)組 － 18.50±3.87★★15.90±3.97★★模型組 － 26.20±5.16▲▲22.10±2.88▲▲婦科千金片低劑量組 0.52 31.90±3.45★ 28.70±4.47★★婦科千金片中劑量組 1.04 34.20±4.32★★30.80±5.03★★婦科千金片高劑量組 2.08 35.00±1.89★★31.40±5.60★★婦炎康組 0.41 32.10±3.21★

4 討論

半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease，caspase）是一類蛋白水解酶，與細(xì)胞凋亡和炎癥關(guān)系密切。其中caspase－3和caspase－8蛋白的表達(dá)有促進(jìn)凋亡作用，caspase－3和caspase－8蛋白觸發(fā)炎癥細(xì)胞凋亡是促進(jìn)炎癥恢復(fù)的機(jī)制之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡途徑主要有內(nèi)源性途徑、外源性途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的ER通路［9］。外源性途徑有兩條，分別是Fas／Fasl信號(hào)途徑和TNFR－1信號(hào)途徑。其中TNFR－1信號(hào)途徑是TNF與TNFR－1結(jié)合，下傳凋亡信號(hào)，活化caspases－8，然后激活下游的caspases－3，引起caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10－11］。

圖1 婦科千金片對(duì)大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspases－3蛋白表達(dá)的影響（×400）A.空白組；B.模型組；C.婦科千金片高劑量組Fig.1 The influence of Fuke Qianjin Tablets to rat′s caspase－3 expression of ovary with chronic pelvic inflammatory disease（×400）A.control group；B.model group；C.high dosage group of Fuke Qianjin Tablets

圖2 婦科千金片對(duì)大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspases－8蛋白表達(dá)的影響（×400）A.空白組；B.模型組；C.婦科千金片高劑量組Fig.2 The influence of Fuke Qianjin Tablets to rat′s caspase－8 expression of ovary with chronic pelvic inflammatory disease（×400）A.control group；B.model group；C.high dosage group of Fuke Qianjin Tablets

近年來(lái)研究表明，T細(xì)胞的活化在慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而caspase－8是T細(xì)胞活化中的重要因子。T細(xì)胞活化過(guò)程中檢測(cè)到多種caspases活性。Alam［12］用抗CD3抗體刺激人外周血單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)caspase－8被活化，同時(shí)還檢測(cè)到其下游的caspase－3的活性。Falk等［13］在實(shí)驗(yàn)中也觀察到，抗CD3／CD28抗體活化T細(xì)胞時(shí)，easpase－3及caspase－8活化，且caspase－8活化在前。在本研究中，在空白組卵巢組織中caspase－3和caspase－8蛋白的光密度最低，提示caspase－3和caspase－8蛋白在正常組織中含量較少。慢性盆腔炎模型組織中caspase－3和caspase－8蛋白的光密度值明顯高于空白組，具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），證明caspase－3和caspase－8蛋白在炎癥反應(yīng)中其表達(dá)上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］。婦科千金片治療后，與模型組比，婦科千金片低、中、高劑量組caspase－3和caspase－8蛋白光密度值明顯升高，具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），證 明 婦 科 千 金 片 可 以 促 進(jìn) caspase－3 和caspase－8蛋白的表達(dá)。提示在慢性盆腔炎模型中，慢性炎癥由活化的T細(xì)胞介導(dǎo)，婦科千金片可能通過(guò)活化T細(xì)胞，進(jìn)而激活caspase－8再活化caspase－3，引起caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)此途徑激發(fā)炎性細(xì)胞凋亡，使慢性炎癥吸收消散，減輕卵巢組織炎性損傷，促進(jìn)卵巢炎癥恢復(fù)。由此caspases能為T細(xì)胞免疫的干預(yù)提供新的思路，并為治療慢性炎癥提供新的途徑。

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