穿山龍?zhí)崛∥锏募兓に囇芯俊?/h1>
2014-11-02 05:43:33劉斌高文學(xué)刁興彬
中國(guó)現(xiàn)代中藥 2014年7期
劉斌，高文學(xué)，刁興彬
(山東省泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 泰安 271000)
中藥工業(yè)
穿山龍?zhí)崛∥锏募兓に囇芯俊?/p>
劉斌，高文學(xué)*，刁興彬
(山東省泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 泰安 271000)
目的研究并建立穿山龍?zhí)崛∥锏募兓に?。方法以總皂苷和薯蕷皂苷綜合評(píng)價(jià)為指標(biāo)，利用大孔吸附樹(shù)脂純化穿山龍?zhí)崛∥?。結(jié)果以生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的上柱液，通過(guò)D-101型大孔吸附樹(shù)脂，依次用4 BV水，體積流量為1 BV·h-1，5 BV 65%乙醇，體積流量為2 BV·h-1洗脫，并收集65%乙醇洗脫流分，減壓干燥，分離轉(zhuǎn)移率平均分別為84.8%、84.2%。結(jié)論該方法穩(wěn)定可行，能較好地純化穿山龍?zhí)崛∥铩?/p>
穿山龍?zhí)崛∥?；總皂苷；薯蕷皂苷；純化；大孔吸附?shù)脂
穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino的干燥根莖[1]，是中國(guó)傳統(tǒng)名藥，也是“泰山四寶”之一。穿山龍中主要藥效成分包括薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、穗菝葜甾苷及其苷元[2-3]。其中薯蕷皂苷可以合成200多種藥物，為合成副腎皮質(zhì)激素以及口服或注射用避孕藥的主要原料，同時(shí)也是心腦血管系統(tǒng)藥物合成的主要原料[4-5]。經(jīng)過(guò)提取純化的穿山龍?zhí)崛∥锼硎氃碥蘸枯^高，成分穩(wěn)定，市場(chǎng)需求非常大，可以滿足大生產(chǎn)的需要。本文以總皂苷及薯蕷皂苷為指標(biāo)成分，對(duì)穿山龍?zhí)崛∥锏奶崛〖兓に囘M(jìn)行系統(tǒng)研究[6-8]，為穿山龍?zhí)崛∥飿?biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Agilent 1260 Series高效液相色譜儀(Agilent 1200 四元泵，VWD檢測(cè)器)，Agilent Chemstation工作站；TU-1901雙波束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析)；十萬(wàn)分之一電子天平(Mettler Toledo XS205)。
1.2 試藥
薯蕷皂苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110717-200501)。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。穿山龍采自泰山，經(jīng)泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心程艷華主任中藥師鑒定為薯蕷科植物穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino的根莖。
2 方法與結(jié)果
2.1 薯蕷皂苷的含量測(cè)定
2.1.1 色譜條件 采用HPLC法，以薯蕷皂苷含量計(jì)。采用ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，乙腈-水(55∶45)為流動(dòng)相，測(cè)定波長(zhǎng)為203 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。
2.1.2 薯蕷皂苷對(duì)照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品15.25 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇制成含薯蕷皂苷305 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。
2.1.3 穿山龍粗提物的制備 稱取穿山龍粉末100 g，用10 BV 60%的乙醇回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾殘?jiān)?，合并濾液，減壓干燥，制備成穿山龍乙醇粗提取物干膏，干燥保存。
2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取2.1.3項(xiàng)下穿山龍粗提取物干膏1.00 g，置于200 mL容量瓶中，用65%乙醇溶解并定容至刻度。分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣。色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。
1.薯蕷皂苷 圖1 薯蕷皂苷對(duì)照品HPLC圖
1.薯蕷皂苷 圖2 穿山龍供試品HPLC圖
2.2 穿山龍總皂苷的測(cè)定
2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 取薯蕷皂苷對(duì)照品13.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取2.1.3項(xiàng)下干膏1.00 g，置于200 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。
2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2.0 mL，置具塞試管中，水浴揮干溶劑，精密加入高氯酸10 mL，于60 ℃水浴加熱15 min，冰水終止反應(yīng)，隨行試劑作為空白溶液。分別在190～500 nm進(jìn)行光譜掃描，薯蕷皂苷及穿山龍總皂苷的吸收曲線基本一致，且都在206 nm 處有最大吸收峰，空白溶液在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收，故選擇206 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。紫外掃描圖見(jiàn)圖3和圖4。
圖3 薯蕷皂苷對(duì)照品紫外掃描圖
圖4 穿山龍供試品紫外掃描圖
2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置具塞試管中，水浴揮干溶劑，精密加入高氯酸10 mL，于60 ℃水浴加熱15 min，冰水終止反應(yīng)，隨行試劑作為空白溶液，在206 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為Y=0.019 11X-0.045 3，r=0.999 4，線性范圍為5.4～54.0 μg·mL-1。
2.3 樹(shù)脂型號(hào)的篩選
采用平行試驗(yàn)，以總皂苷及薯蕷皂苷為指標(biāo)成分，利用靜態(tài)吸附，篩選文獻(xiàn)中常用于分離皂苷類的不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂色譜柱。
2.3.1 比吸附量考察 將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的4種大孔樹(shù)脂D-101、AB-8、HPD-600、HP-20去除表面水后各取5 g分別置于具塞磨口錐形瓶中，各精密加入樣品溶液25 mL，置搖床中，振搖24 h，使樹(shù)脂充分吸附，過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明D101對(duì)于本品比吸附較好，見(jiàn)表1。計(jì)算公式：
(1)
式中：m1為吸附前溶液中成分質(zhì)量(mg)；m2為吸附后溶液中成分質(zhì)量(mg)；m為樹(shù)脂重量(g)
表1 不同大孔樹(shù)脂比吸附值考察
2.3.2 解吸率考察 將2.3.1項(xiàng)下樣品置于具塞磨口錐形瓶中，精密加入50%乙醇100 mL，置搖床中，具塞振搖24 h，充分解吸附，過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明4種樹(shù)脂的解吸率相差不大，綜合比較吸附值與解吸率的結(jié)果，D-101樹(shù)脂有較好的吸附性及解吸率，作為本品的分離用樹(shù)脂較理想。見(jiàn)表2。計(jì)算公式：
(2)
式中：m為樹(shù)脂吸附的成分質(zhì)量(mg)；m3為解吸附后溶液中成分質(zhì)量(mg)
表2 不同大孔樹(shù)脂解吸率考察
2.4 上樣藥液濃度對(duì)吸附效果的影響
分別稱取10 g樹(shù)脂分裝于同一型號(hào)樹(shù)脂柱中，取1 mL相當(dāng)于1 g生藥的樣品溶液，加水或濃縮配制成相當(dāng)于原藥液的0.25，0.5，1，2 BV的4種不同濃度的藥液，依次精密量取5，10，20，40 mL的藥液，上柱(體積小于柱體積的上樣后靜置2 h，體積大于柱體積的以流速為1 BV·h-1循環(huán)上樣2 h)，收集過(guò)柱液體置100 mL量瓶中，加65%乙醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)行含量測(cè)定并按公式(1)計(jì)算比吸附量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥液每毫升相當(dāng)于原藥材量2 g時(shí)，濃度過(guò)大，色譜柱堵塞，溶液無(wú)法流下，需要頻繁處理，因此上樣時(shí)藥液合理的濃度為每毫升相當(dāng)于1 g生藥量，即1 000 g穿山龍藥材濃縮至1 000 mL即可。見(jiàn)表3。
2.5 上樣藥液體積流速的考察
分別稱取10 g樹(shù)脂分裝于同一型號(hào)樹(shù)脂柱中，精密量取樣品溶液10 mL，分別以0.5，1，2，3 BV·h-1的流速吸附上柱，收集過(guò)柱后溶液，用65%定容至100 mL，測(cè)定含量并按公式(1)計(jì)算比吸附量。結(jié)果表明隨體積流速的增大，樹(shù)脂吸附量呈下降趨勢(shì)；0.5，1 BV·h-1吸附量較大且結(jié)果相近，考慮到工作效率的問(wèn)題，選擇1 BV·h-1體積流速。見(jiàn)表4。
表3 上樣藥液濃度對(duì)吸附效果的影響考察
表4 上樣藥液體積流速的考察
2.6 徑高比的考察
分別稱取處理過(guò)的大孔樹(shù)脂適量，置于同樣型號(hào)樹(shù)脂柱中，使徑高比分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶12，依據(jù)樹(shù)脂重量精密加入適量樣品溶液，按1 BV·h-1體積流速吸附上樣，收集過(guò)柱流出液，測(cè)定含量并按公式(1)計(jì)算比吸附量。結(jié)果表明不同的徑高比對(duì)皂苷吸附量有一定的影響，當(dāng)徑高比在1∶2～1∶8時(shí)，吸附逐漸增大，繼續(xù)增加徑高比后無(wú)變化，因此采用徑高比為1∶8。見(jiàn)表5。
表5 徑高比考察
2.7 洗脫劑的考察
取大孔樹(shù)脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，經(jīng)預(yù)處理后，取原藥液8 mL，分別用水、25%乙醇、40%乙醇、65%乙醇、80%乙醇、95%乙醇各80 mL，以1 BV·h-1的體積流度梯度洗脫，前1倍柱體積洗脫液棄去，然后依次收集上述洗脫液，每次20 mL，分別測(cè)定總皂苷含量及洗脫液中固形物重量，1～4次為水；5～8次為25%乙醇；9～12次為40%乙醇；13～16次為65%乙醇；17～20次為80%乙醇；21～24次為95%乙醇。測(cè)定結(jié)果表明穿山龍總皂苷主要集中在25%～65%乙醇洗脫液中，占全部醇洗脫液中穿山龍總皂苷的89.1%，洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)皂苷洗脫變化不大；多數(shù)固形物存在于蒸餾水洗脫液中，這表明僅用水洗能夠得到很好的除雜效果，所以洗脫溶劑確定為先用水除去大量水溶性雜質(zhì)，再用65%乙醇洗脫，并收集65%乙醇洗脫流分。見(jiàn)表6。
表6 洗脫劑的考察
2.8 洗脫劑用量考察
2.8.1 水洗脫用量考察 稱取已處理過(guò)的樹(shù)脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，取原藥液8 mL，上樣，水洗流速為1 BV·h-1，收集上述洗脫液，1 BV收集1份，分別測(cè)定總皂苷含量及洗脫液中固形物量。結(jié)果表明水洗至5 BV時(shí)，流出液中所含固形物量己經(jīng)很少了，當(dāng)水洗體積為4 BV時(shí)水溶性雜質(zhì)基本除去，且皂苷類成分損失不大，故確定水的洗脫用量為4 BV。見(jiàn)表7。
表7 水洗脫用量的考察
2.8.2 65%乙醇洗脫用量考察 稱取已處理過(guò)的樹(shù)脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，移取原藥液8 mL，上樣，用4 BV水，采用1 BV·h-1沖洗，然后用65%乙醇洗脫，收集洗脫液，1 BV收集1份，分別測(cè)定總皂苷和薯蕷皂苷的含量。結(jié)果表明65%乙醇洗至6倍柱體積時(shí)，流出液中所含總皂苷及薯蕷皂苷的含量己經(jīng)很少了，即5 BV時(shí)已經(jīng)洗脫充分了，故確定65%乙醇的洗脫用量為5 BV。見(jiàn)表8。
2.9 洗脫流速的考察
稱取已處理過(guò)的樹(shù)脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，取原藥液8 mL，上樣，用4 BV的水，采用1 BV·h-1沖洗，然后用5 BV的65%乙醇洗脫，采用不同體積流量沖洗，收集洗脫液，各定容至100 mL，分別測(cè)定總皂苷和薯蕷皂苷的含量。結(jié)果表明，隨洗脫體積流量的增加，洗脫下來(lái)的皂苷量逐漸減少，分析是因?yàn)榱魉偬?，洗脫液還未與皂苷充分接觸，所以洗脫下來(lái)量少。1，2 BV·h-1體積流量洗脫下來(lái)皂苷量差不多，為提高工作效率，選擇2 BV·h-1合適。見(jiàn)表9。
表8 65%乙醇洗脫用量的考察
表9 體積流量的考察
2.10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
分別取處理過(guò)的大孔吸附樹(shù)脂100 g，平行3份，分別吸取穿山龍生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的提取液80 mL，按照上述工藝依法上柱，依次洗脫后，減壓干燥，分別測(cè)定提取液和洗脫液中總皂苷與薯蕷皂苷的總含量，并計(jì)算洗脫率。結(jié)果表明穿山龍?zhí)崛∥锝?jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后有效的降低了固形物的量，提高了總皂苷和薯蕷皂苷的含量，洗脫率平均分別為84.8%、84.2%，RSD分別為0.49%、0.65%，表明該工藝穩(wěn)定，可行。見(jiàn)表10。
表10 穿山龍?zhí)崛∥锛兓に囼?yàn)證實(shí)驗(yàn)
3 結(jié)果與討論
試驗(yàn)以穿山龍中總皂苷和薯蕷皂苷為指標(biāo)，對(duì)穿山龍?zhí)崛∥锏募兓に囘M(jìn)行研究，達(dá)到了較好的純化效果，且工藝穩(wěn)定可行。通過(guò)對(duì)大孔吸附樹(shù)脂純化穿山龍?zhí)崛∥锕に嚨难芯浚_定純化工藝為采用D-101型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化，徑高比為1∶8，上樣藥液生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，用4 BV純化水，體積流量為1 BV·h-1，除去雜質(zhì)，再用5 BV 65%乙醇，體積流量為2 BV·h-1洗脫。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該工藝下，總皂苷和薯蕷皂苷的分離洗脫率均達(dá)到80%以上。
中藥成分復(fù)雜，可以通過(guò)現(xiàn)代中藥提取純化技術(shù)，制備中藥提取物，提高有效成分的純度。本研究根據(jù)穿山龍藥材中總皂苷和薯蕷皂苷的理化性質(zhì)及目前大生產(chǎn)的實(shí)際情況，采用D-101型大孔樹(shù)脂純化穿山龍?zhí)崛∥?，使有效成分富集，且穩(wěn)定性好，為今后穿山龍?zhí)崛∥锏臉?biāo)準(zhǔn)化建立和生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。
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StudyonPurificationProcessofExtractsfromDioscoreanipponica
LIUBin，GAOWenxue*，DIAOXingbin
(TaianTestingCenterforFoodandDrugControl，Taian271000，China)
Objective：This study aimed to establish the best purification technique for the extraction process ofDioscoreanipponica.MethodsUse the total saponins and diosgenin comprehensive evalution as index，and to purify the extraction fromD.nipponicaby means of macroporous adsorption resin.ResultsThe results showed that after going through the D101 macroporous adsorption resin，eluting by means of 4BV water(1 BV·h-1)，5BV 65% ethanol(2 BV·h-1)，and collecting the dried 65% elute ethanol，the average separation of transfer rate is 84.8% and 84.2%.ConclusionThe process is proved reliable and stable to purify the astraction fromD.nipponica.
Dioscoreanipponicaextracts；Total saponins；Diosgenin；Purification；Macroporous adsorption resin
泰安市科技發(fā)展計(jì)劃(20123080)
*
高文學(xué)，副主任藥師，研究方向：藥品檢驗(yàn)；Tel：(0538)8334565
10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.012
2013-11-25)
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Agilent 1260 Series高效液相色譜儀(Agilent 1200 四元泵，VWD檢測(cè)器)，Agilent Chemstation工作站；TU-1901雙波束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析)；十萬(wàn)分之一電子天平(Mettler Toledo XS205)。
1.2 試藥
薯蕷皂苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110717-200501)。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。穿山龍采自泰山，經(jīng)泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心程艷華主任中藥師鑒定為薯蕷科植物穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino的根莖。
2 方法與結(jié)果
2.1 薯蕷皂苷的含量測(cè)定
2.1.1 色譜條件 采用HPLC法，以薯蕷皂苷含量計(jì)。采用ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，乙腈-水(55∶45)為流動(dòng)相，測(cè)定波長(zhǎng)為203 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。
2.1.2 薯蕷皂苷對(duì)照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品15.25 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇制成含薯蕷皂苷305 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。
2.1.3 穿山龍粗提物的制備 稱取穿山龍粉末100 g，用10 BV 60%的乙醇回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾殘?jiān)?，合并濾液，減壓干燥，制備成穿山龍乙醇粗提取物干膏，干燥保存。
2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取2.1.3項(xiàng)下穿山龍粗提取物干膏1.00 g，置于200 mL容量瓶中，用65%乙醇溶解并定容至刻度。分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣。色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。
1.薯蕷皂苷 圖1 薯蕷皂苷對(duì)照品HPLC圖
1.薯蕷皂苷 圖2 穿山龍供試品HPLC圖
2.2 穿山龍總皂苷的測(cè)定
2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 取薯蕷皂苷對(duì)照品13.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取2.1.3項(xiàng)下干膏1.00 g，置于200 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。
2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2.0 mL，置具塞試管中，水浴揮干溶劑，精密加入高氯酸10 mL，于60 ℃水浴加熱15 min，冰水終止反應(yīng)，隨行試劑作為空白溶液。分別在190～500 nm進(jìn)行光譜掃描，薯蕷皂苷及穿山龍總皂苷的吸收曲線基本一致，且都在206 nm 處有最大吸收峰，空白溶液在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收，故選擇206 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。紫外掃描圖見(jiàn)圖3和圖4。
圖3 薯蕷皂苷對(duì)照品紫外掃描圖
圖4 穿山龍供試品紫外掃描圖
2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置具塞試管中，水浴揮干溶劑，精密加入高氯酸10 mL，于60 ℃水浴加熱15 min，冰水終止反應(yīng)，隨行試劑作為空白溶液，在206 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為Y=0.019 11X-0.045 3，r=0.999 4，線性范圍為5.4～54.0 μg·mL-1。
2.3 樹(shù)脂型號(hào)的篩選
采用平行試驗(yàn)，以總皂苷及薯蕷皂苷為指標(biāo)成分，利用靜態(tài)吸附，篩選文獻(xiàn)中常用于分離皂苷類的不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂色譜柱。
2.3.1 比吸附量考察 將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的4種大孔樹(shù)脂D-101、AB-8、HPD-600、HP-20去除表面水后各取5 g分別置于具塞磨口錐形瓶中，各精密加入樣品溶液25 mL，置搖床中，振搖24 h，使樹(shù)脂充分吸附，過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明D101對(duì)于本品比吸附較好，見(jiàn)表1。計(jì)算公式：
(1)
式中：m1為吸附前溶液中成分質(zhì)量(mg)；m2為吸附后溶液中成分質(zhì)量(mg)；m為樹(shù)脂重量(g)
表1 不同大孔樹(shù)脂比吸附值考察
2.3.2 解吸率考察 將2.3.1項(xiàng)下樣品置于具塞磨口錐形瓶中，精密加入50%乙醇100 mL，置搖床中，具塞振搖24 h，充分解吸附，過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明4種樹(shù)脂的解吸率相差不大，綜合比較吸附值與解吸率的結(jié)果，D-101樹(shù)脂有較好的吸附性及解吸率，作為本品的分離用樹(shù)脂較理想。見(jiàn)表2。計(jì)算公式：
(2)
式中：m為樹(shù)脂吸附的成分質(zhì)量(mg)；m3為解吸附后溶液中成分質(zhì)量(mg)
表2 不同大孔樹(shù)脂解吸率考察
2.4 上樣藥液濃度對(duì)吸附效果的影響
分別稱取10 g樹(shù)脂分裝于同一型號(hào)樹(shù)脂柱中，取1 mL相當(dāng)于1 g生藥的樣品溶液，加水或濃縮配制成相當(dāng)于原藥液的0.25，0.5，1，2 BV的4種不同濃度的藥液，依次精密量取5，10，20，40 mL的藥液，上柱(體積小于柱體積的上樣后靜置2 h，體積大于柱體積的以流速為1 BV·h-1循環(huán)上樣2 h)，收集過(guò)柱液體置100 mL量瓶中，加65%乙醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)行含量測(cè)定并按公式(1)計(jì)算比吸附量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥液每毫升相當(dāng)于原藥材量2 g時(shí)，濃度過(guò)大，色譜柱堵塞，溶液無(wú)法流下，需要頻繁處理，因此上樣時(shí)藥液合理的濃度為每毫升相當(dāng)于1 g生藥量，即1 000 g穿山龍藥材濃縮至1 000 mL即可。見(jiàn)表3。
2.5 上樣藥液體積流速的考察
分別稱取10 g樹(shù)脂分裝于同一型號(hào)樹(shù)脂柱中，精密量取樣品溶液10 mL，分別以0.5，1，2，3 BV·h-1的流速吸附上柱，收集過(guò)柱后溶液，用65%定容至100 mL，測(cè)定含量并按公式(1)計(jì)算比吸附量。結(jié)果表明隨體積流速的增大，樹(shù)脂吸附量呈下降趨勢(shì)；0.5，1 BV·h-1吸附量較大且結(jié)果相近，考慮到工作效率的問(wèn)題，選擇1 BV·h-1體積流速。見(jiàn)表4。
表3 上樣藥液濃度對(duì)吸附效果的影響考察
表4 上樣藥液體積流速的考察
2.6 徑高比的考察
分別稱取處理過(guò)的大孔樹(shù)脂適量，置于同樣型號(hào)樹(shù)脂柱中，使徑高比分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶12，依據(jù)樹(shù)脂重量精密加入適量樣品溶液，按1 BV·h-1體積流速吸附上樣，收集過(guò)柱流出液，測(cè)定含量并按公式(1)計(jì)算比吸附量。結(jié)果表明不同的徑高比對(duì)皂苷吸附量有一定的影響，當(dāng)徑高比在1∶2～1∶8時(shí)，吸附逐漸增大，繼續(xù)增加徑高比后無(wú)變化，因此采用徑高比為1∶8。見(jiàn)表5。
表5 徑高比考察
2.7 洗脫劑的考察
取大孔樹(shù)脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，經(jīng)預(yù)處理后，取原藥液8 mL，分別用水、25%乙醇、40%乙醇、65%乙醇、80%乙醇、95%乙醇各80 mL，以1 BV·h-1的體積流度梯度洗脫，前1倍柱體積洗脫液棄去，然后依次收集上述洗脫液，每次20 mL，分別測(cè)定總皂苷含量及洗脫液中固形物重量，1～4次為水；5～8次為25%乙醇；9～12次為40%乙醇；13～16次為65%乙醇；17～20次為80%乙醇；21～24次為95%乙醇。測(cè)定結(jié)果表明穿山龍總皂苷主要集中在25%～65%乙醇洗脫液中，占全部醇洗脫液中穿山龍總皂苷的89.1%，洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)皂苷洗脫變化不大；多數(shù)固形物存在于蒸餾水洗脫液中，這表明僅用水洗能夠得到很好的除雜效果，所以洗脫溶劑確定為先用水除去大量水溶性雜質(zhì)，再用65%乙醇洗脫，并收集65%乙醇洗脫流分。見(jiàn)表6。
表6 洗脫劑的考察
2.8 洗脫劑用量考察
2.8.1 水洗脫用量考察 稱取已處理過(guò)的樹(shù)脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，取原藥液8 mL，上樣，水洗流速為1 BV·h-1，收集上述洗脫液，1 BV收集1份，分別測(cè)定總皂苷含量及洗脫液中固形物量。結(jié)果表明水洗至5 BV時(shí)，流出液中所含固形物量己經(jīng)很少了，當(dāng)水洗體積為4 BV時(shí)水溶性雜質(zhì)基本除去，且皂苷類成分損失不大，故確定水的洗脫用量為4 BV。見(jiàn)表7。
表7 水洗脫用量的考察
2.8.2 65%乙醇洗脫用量考察 稱取已處理過(guò)的樹(shù)脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，移取原藥液8 mL，上樣，用4 BV水，采用1 BV·h-1沖洗，然后用65%乙醇洗脫，收集洗脫液，1 BV收集1份，分別測(cè)定總皂苷和薯蕷皂苷的含量。結(jié)果表明65%乙醇洗至6倍柱體積時(shí)，流出液中所含總皂苷及薯蕷皂苷的含量己經(jīng)很少了，即5 BV時(shí)已經(jīng)洗脫充分了，故確定65%乙醇的洗脫用量為5 BV。見(jiàn)表8。
2.9 洗脫流速的考察
稱取已處理過(guò)的樹(shù)脂10 g，濕法裝柱(徑高比為1∶8)，取原藥液8 mL，上樣，用4 BV的水，采用1 BV·h-1沖洗，然后用5 BV的65%乙醇洗脫，采用不同體積流量沖洗，收集洗脫液，各定容至100 mL，分別測(cè)定總皂苷和薯蕷皂苷的含量。結(jié)果表明，隨洗脫體積流量的增加，洗脫下來(lái)的皂苷量逐漸減少，分析是因?yàn)榱魉偬?，洗脫液還未與皂苷充分接觸，所以洗脫下來(lái)量少。1，2 BV·h-1體積流量洗脫下來(lái)皂苷量差不多，為提高工作效率，選擇2 BV·h-1合適。見(jiàn)表9。
表8 65%乙醇洗脫用量的考察
表9 體積流量的考察
2.10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
分別取處理過(guò)的大孔吸附樹(shù)脂100 g，平行3份，分別吸取穿山龍生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的提取液80 mL，按照上述工藝依法上柱，依次洗脫后，減壓干燥，分別測(cè)定提取液和洗脫液中總皂苷與薯蕷皂苷的總含量，并計(jì)算洗脫率。結(jié)果表明穿山龍?zhí)崛∥锝?jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后有效的降低了固形物的量，提高了總皂苷和薯蕷皂苷的含量，洗脫率平均分別為84.8%、84.2%，RSD分別為0.49%、0.65%，表明該工藝穩(wěn)定，可行。見(jiàn)表10。
表10 穿山龍?zhí)崛∥锛兓に囼?yàn)證實(shí)驗(yàn)
3 結(jié)果與討論
試驗(yàn)以穿山龍中總皂苷和薯蕷皂苷為指標(biāo)，對(duì)穿山龍?zhí)崛∥锏募兓に囘M(jìn)行研究，達(dá)到了較好的純化效果，且工藝穩(wěn)定可行。通過(guò)對(duì)大孔吸附樹(shù)脂純化穿山龍?zhí)崛∥锕に嚨难芯浚_定純化工藝為采用D-101型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化，徑高比為1∶8，上樣藥液生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，用4 BV純化水，體積流量為1 BV·h-1，除去雜質(zhì)，再用5 BV 65%乙醇，體積流量為2 BV·h-1洗脫。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該工藝下，總皂苷和薯蕷皂苷的分離洗脫率均達(dá)到80%以上。
中藥成分復(fù)雜，可以通過(guò)現(xiàn)代中藥提取純化技術(shù)，制備中藥提取物，提高有效成分的純度。本研究根據(jù)穿山龍藥材中總皂苷和薯蕷皂苷的理化性質(zhì)及目前大生產(chǎn)的實(shí)際情況，采用D-101型大孔樹(shù)脂純化穿山龍?zhí)崛∥?，使有效成分富集，且穩(wěn)定性好，為今后穿山龍?zhí)崛∥锏臉?biāo)準(zhǔn)化建立和生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。
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StudyonPurificationProcessofExtractsfromDioscoreanipponica
LIUBin，GAOWenxue*，DIAOXingbin
(TaianTestingCenterforFoodandDrugControl，Taian271000，China)
Objective：This study aimed to establish the best purification technique for the extraction process ofDioscoreanipponica.MethodsUse the total saponins and diosgenin comprehensive evalution as index，and to purify the extraction fromD.nipponicaby means of macroporous adsorption resin.ResultsThe results showed that after going through the D101 macroporous adsorption resin，eluting by means of 4BV water(1 BV·h-1)，5BV 65% ethanol(2 BV·h-1)，and collecting the dried 65% elute ethanol，the average separation of transfer rate is 84.8% and 84.2%.ConclusionThe process is proved reliable and stable to purify the astraction fromD.nipponica.
Dioscoreanipponicaextracts；Total saponins；Diosgenin；Purification；Macroporous adsorption resin
泰安市科技發(fā)展計(jì)劃(20123080)
*
高文學(xué)，副主任藥師，研究方向：藥品檢驗(yàn)；Tel：(0538)8334565
10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.012
2013-11-25)
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