山東產(chǎn)區(qū)黃芩HPLC定量指紋圖譜研究△

趙恒強(qiáng)，王曉*，周潔，周思多，2，東莎莎，耿巖玲，劉建華，楊丙田，楊鵬

(1.山東省科學(xué)院 中藥過程控制研究中心/山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018； 3.濟(jì)南三峰生物工程技術(shù)有限公司，山東 濟(jì)南 251400)

山東產(chǎn)區(qū)黃芩HPLC定量指紋圖譜研究△

趙恒強(qiáng)1，王曉1*，周潔1，周思多1，2，東莎莎1，耿巖玲1，劉建華1，楊丙田3，楊鵬3

(1.山東省科學(xué)院 中藥過程控制研究中心/山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018； 3.濟(jì)南三峰生物工程技術(shù)有限公司，山東 濟(jì)南 251400)

目的建立山東產(chǎn)區(qū)黃芩藥材定量指紋圖譜，為黃芩藥材的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量控制提供方法支持。方法采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，乙腈-水(含1%甲酸、20 mmol·L-1甲酸銨)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測波長為274 nm，進(jìn)樣量5 μL，進(jìn)行了10批次黃芩藥材的分析。結(jié)果該分析方法具有良好的精密度、重現(xiàn)性，10批黃芩指紋圖譜有17個(gè)共有峰，4個(gè)特征峰，采用ESI-TOF/MS 對4 個(gè)特征峰進(jìn)行了指認(rèn)，10個(gè)批次山東產(chǎn)黃芩樣品中6種黃酮類化合物含量分布規(guī)律相似，其相似度系數(shù)均大于0.955 7。結(jié)論黃芩HPLC定量指紋圖譜有望成為黃芩樣品真?zhèn)舞b別及質(zhì)量控制的有力工具。

黃芩；HPLC；定量指紋圖譜

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傳統(tǒng)常用中藥，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎功能[1-2]。黃芩是我國中醫(yī)臨床常用大宗藥材品種之一，山東省黃芩藥材種植面積較大，全省種植面積在6 667 hm2以上[3]。

目前，黃芩的質(zhì)量控制方法主要是采用單指標(biāo)成分對其進(jìn)行質(zhì)量控制，2010版《中國藥典》中采用黃芩苷含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)[1]，但是單一的指標(biāo)成分難以反映中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，是當(dāng)前符合中藥特色的評價(jià)中藥真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性的質(zhì)量控制模式，具有整體性、模糊性等特點(diǎn)，體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性的基本原則[4-6]。指紋圖譜目前已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制中，在黃芩質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別中也有大量應(yīng)用[7-9]。但是，已有的指紋圖譜方法主要是對共有峰的指認(rèn)及結(jié)合模式識別等方法對其進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)和產(chǎn)地鑒別，缺少特征峰的含量信息。指紋圖譜技術(shù)與多指標(biāo)成分定量相結(jié)合可以更加全面地反應(yīng)中藥質(zhì)量特點(diǎn)，是一種值得繼續(xù)探索的中藥質(zhì)量控制模式，果德安等對其進(jìn)行了大量研究工作[10-11]。而有關(guān)多指標(biāo)定量指紋圖譜技術(shù)在黃芩質(zhì)量控制中的研究應(yīng)用未見報(bào)道。

本研究采用HPLC建立山東產(chǎn)區(qū)黃芩樣品的多指標(biāo)定量指紋圖譜，為有效控制黃芩藥材質(zhì)量，保證建立符合規(guī)模化生產(chǎn)的黃芩基地及生產(chǎn)過程控制提供方法和技術(shù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配有二極管陣列(DAD)檢測器，四元泵，柱溫箱，自動進(jìn)樣器等；G6520型四級桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國Agilent公司)；KQ-400KDE型超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q(18.2 MΩ)超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)；THZ-8 恒溫水浴鍋(中國浙江嘉興電熱儀器廠)。

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent公司)，Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent公司)，Waters XBridgeTMC18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Waters公司)，依利特Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特)。

1.2 材料

黃芩苷(批號：110715-200514)、黃芩素(批號：111595-200905)、漢黃芩素(批號：111514-200403)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；漢黃芩苷(批號：20090319)、黃芩新素(批號：20090617)、千層紙素A(批號：20091124)對照品均購自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，純度均大于98.5%。甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific)，甲醇(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)，甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，甲酸銨(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為分析純，水為自制Milli-Q超純水，其余試劑均為分析純。

本研究采集的10個(gè)不同批次的黃芩樣品分別于2011～2012年購自濟(jì)南市各大藥店及山東各GAP種植基地，經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 黃芩樣品信息

黃芩樣品置于烘箱中55 ℃鼓風(fēng)干燥4 h，然后置于真空干燥箱中55 ℃干燥4 h至干。干燥后粉碎，過40目篩，混合均勻，制備成黃芩干粉樣品，密閉、避光、干燥、常溫貯藏。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.5 g黃芩干粉樣品，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲提取10 min(提取功率320 W，頻率40 Hz)，在52～55 ℃條件下將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用甲醇重新溶解，并定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜后作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取5.0 mg黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩新素、千層紙素 A對照品置50 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度作為對照品溶液。

2.3 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A：1%甲酸、20 mmol·L-1甲酸銨的水溶液，流動相B：乙腈，流速為0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長為274 nm，進(jìn)樣量為5 μL，按表2進(jìn)行梯度洗脫，黃芩樣品HPLC分析圖見圖1。

2.4 質(zhì)譜條件

ESI-MS工作條件如下：色譜柱后分流進(jìn)入質(zhì)譜的流動相流速為0.4 mL·min-1，正離子電離模式，霧化氣壓力45 psi，干燥氣(N2)流速10.0 L·min-1，干燥氣體溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓4 500 V，裂解電壓：100 V；錐孔電壓：60 V，全掃描(Scan)質(zhì)荷比(m/z)范圍為50～1 000。

表2 流動相梯度條件 /%

圖1 黃芩HPLC-DAD圖譜(274 nm)

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限 按2.3色譜條件進(jìn)樣分析，測定各不同質(zhì)量濃度(0.10，0.20，0.50，1.00，10.00，50.00 μg·mL-1)混合對照品溶液中各化合物的峰面積，以各化合物質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程(見表3)。將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至低濃度進(jìn)樣，以3倍信噪比計(jì)算各成分的檢測限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果見表3。

表3 6種黃酮HPLC分析回歸方程、線性范圍及檢測限、定量限測定結(jié)果

2.5.2 精密度試驗(yàn) 按照2.1供試樣品的制備方法制備供試溶液，按照2.3色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次測定，分別測得其中4個(gè)主要峰(分別為峰4，10，13，14)的峰面積和保留時(shí)間，分別計(jì)算其RSD。4個(gè)主峰峰面積和保留時(shí)間的RSD值在0.12%～0.78% 和0.09%～0.25%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一黃芩樣品6份，按照2.1供試樣品的制備方法分別制成供試品溶液，按照2.3的色譜條件，進(jìn)行色譜分析，測得4個(gè)特征峰的峰面積和保留時(shí)間，并計(jì)算其RSD，4個(gè)主要峰(分別為峰4，10，13，14)峰面積和保留時(shí)間的RSD值分別在1.42%～3.58%和0.11%～0.21%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照2.1供試樣品的制備方法制備供試溶液，按照2.3的色譜條件，分別在0，1，3，6，12，24，48，72 h進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示黃芩提取物溶液的峰面積和保留時(shí)間無明顯變化，4個(gè)主要峰(分別為峰4，10，13，14)峰面積和保留時(shí)間的RSD 值分別在1.67%～3.90%和0.59%～2.09%，說明供試品溶液在72 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含各對照品含量的黃芩樣品0.50 g，按高、中、低3種濃度分別準(zhǔn)確加入黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩新素、千層紙素 A對照品適量，按照供試品溶液制備方法處理6 份，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測定各對照品峰面積，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 黃芩中各成分加樣回收率試驗(yàn)

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1指紋圖譜的建立 取10批黃芩樣品，按2.1供試品溶液制備方法將其制備成供試品溶液，按2.3HPLC色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，建立黃芩樣品的HPLC指紋圖譜，10批黃芩樣品的色譜圖見圖2。從圖2可以看出10批黃芩樣品的指紋圖譜差異不大，因此，10批黃芩樣品均可用于共有峰的確定。10批黃芩樣品HPLC指紋圖譜的共有峰有17個(gè)(較大的峰，已扣除溶劑峰)。

圖2 山東產(chǎn)區(qū)10批黃芩HPLC指紋圖譜

在本研究所建立的分析系統(tǒng)下，黃芩甲醇提取物各成分出峰時(shí)間主要在50 min之前，特征性明顯的主要有4個(gè)色譜峰，這4個(gè)色譜峰即構(gòu)成黃芩HPLC指紋圖譜的特征峰(分別為峰4，10，13，14)，其中以峰高最高的10號峰為指標(biāo)峰，該峰化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，保留時(shí)間以及峰面積重復(fù)性良好，與其他相鄰峰分離良好，采用化學(xué)工作站計(jì)算該峰的純度表明該峰為一純化合物。因此選擇10號峰為指標(biāo)峰(保留時(shí)間和峰面積均設(shè)為1)，用于計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果表明，山東產(chǎn)區(qū)10批黃芩樣品各共有峰保留時(shí)間的RSD均在5%以內(nèi)，各共有峰相對峰面積的RSD相差較大，但其譜圖輪廓一致。

2.6.2 特征峰的指認(rèn) 采用對照品和高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-TOF/MS)對黃芩指紋圖譜中的特征峰進(jìn)行分析，HPLC工作條件同2.3色譜條件，在選定的實(shí)驗(yàn)條件下對黃芩甲醇提取物進(jìn)行分析，獲得其總離子流色譜圖，黃芩指紋圖譜中的4個(gè)特征峰的精確質(zhì)量測量結(jié)果見表5。

表5 黃芩甲醇提取物中4個(gè)化合物的HPLC-ESI-TOF/MS精確質(zhì)量測量結(jié)果

2.6.3 相似度評價(jià) 通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(《中國藥典》2004 A版)對10批黃芩樣品進(jìn)行相似度分析。首先將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，選定上述17個(gè)共有峰進(jìn)行譜峰匹配，采用共有模式作為對照指紋圖譜，用于10批黃芩樣品相似度評價(jià)，見表6。

表6 山東產(chǎn)區(qū)10批黃芩藥材相似度評價(jià)結(jié)果

從表6可以看出，10批山東產(chǎn)區(qū)的黃芩樣品指紋圖譜相似度較高，均在0.955 7以上。研究結(jié)果為山東產(chǎn)區(qū)黃芩藥材的質(zhì)量控制研究提供了依據(jù)。

2.7 黃芩樣品測定

按2.1供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按2.3色譜條件分別進(jìn)樣分析，獲得山東產(chǎn)區(qū)10批黃芩樣品中6個(gè)共有峰所對應(yīng)化合物的色譜峰面積，將測得結(jié)果代入表3線性回歸方程，計(jì)算黃芩樣品中各化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(見表7)。從表7可以看出，山東產(chǎn)區(qū)10個(gè)批次的黃芩樣品中6種黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布規(guī)律相似。

表7 山東產(chǎn)區(qū)10批黃芩中6種黃酮類化合物的測定(n=3) /%

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

本研究采用2.3色譜條件，采用超聲提取技術(shù)，首先對黃芩不同提取溶劑(水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇)提取物溶液進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，當(dāng)水或25%甲醇作為提取溶劑時(shí)，中間段色譜峰峰高較低，提取較差；后三者相比，100%甲醇作為提取溶劑時(shí)，所得色譜圖色譜峰信號較強(qiáng)，且各峰分離度好、基線平穩(wěn)，指紋特征明顯，因此選擇100%甲醇作為黃芩指紋圖譜樣品提取溶劑。

在優(yōu)化的提取溶劑條件下，考察了不同料液比(1∶20、1∶50、1∶80)對提取率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，黃芩各成分提取率較高。進(jìn)一步考察了不同提取時(shí)間(5，10，15 min)對黃芩成分提取率的影響，結(jié)果表明當(dāng)提取時(shí)間為10 min時(shí)，黃芩各成分已基本提取完全。

3.2 色譜條件優(yōu)化

黃芩甲醇提取物化學(xué)成分復(fù)雜，采用等度洗脫的方法很難將黃芩醇提物中的多種化合物分離開，因此采用線性梯度洗脫方式進(jìn)行分離。本研究對儀器與試藥中所列的4根不同生產(chǎn)廠家的色譜柱進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱獲得的黃芩醇提物指紋圖譜各峰分離度高，色譜峰分布均勻，峰型較好，具有較好的代表性，因此選擇Agilent ZORBAX SB-C18柱用于黃芩藥材的指紋圖譜研究。在此基礎(chǔ)上，比較了甲醇-水、乙腈-水作為流動相時(shí)的色譜圖效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-水效果明顯優(yōu)于甲醇-水。黃芩含有多種化學(xué)成分，其中黃酮類化合物為主要有效成分，其大多呈弱酸性，因此實(shí)驗(yàn)中加入甲酸、甲酸銨調(diào)節(jié)流動相pH以改善分離度和色譜峰形，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以1%甲酸、20 mmol·L-1甲酸銨水溶液-乙腈為流動相時(shí)，色譜指紋圖譜效果最好。通過二極管陣列檢測器全波段掃描(190～400 nm)，考察了不同檢測波長對指紋圖譜的影響，結(jié)果表明，在UV 274 nm條件下檢測獲得的色譜指紋圖譜信息量大，指紋峰特征性強(qiáng)，具有較好的代表性，因此選擇274 nm作為黃芩HPLC指紋圖譜研究的檢測波長(見圖1)。

3.3 指紋圖譜評價(jià)

本研究在多批次樣品分析的基礎(chǔ)上，建立了山東產(chǎn)區(qū)黃芩樣品的HPLC指紋圖譜，選取了17個(gè)穩(wěn)定性好，特征性明顯的峰作為共有峰，并采用對照品和ESI-TOF/MS技術(shù)對4個(gè)特征峰進(jìn)行了指認(rèn)，分別為：峰4(漢黃芩苷)、峰10(黃芩素)、峰13(黃芩苷)、峰14(漢黃芩素)。采用相似度分析對山東產(chǎn)區(qū)的10批黃芩樣品進(jìn)行了對比，結(jié)果表明，相似度系數(shù)均大于0.955 7。定量分析結(jié)果表明，山東產(chǎn)區(qū)的10批黃芩樣品中6種黃酮類化合物含量分布規(guī)律相似。黃芩為大宗常用中藥材，本研究建立的山東產(chǎn)區(qū)黃芩HPLC多指標(biāo)定量指紋圖譜，為山東產(chǎn)區(qū)黃芩藥材的質(zhì)量控制研究提供了方法和技術(shù)支持。

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StudyOnQuantitativeHPLCFingerprintofScutellariabaicalensisGeorgi

ZHAOHengqiang1，WANGXiao1，ZHOUJie1，ZHOUSiduo1，2，DONGShasha1，GENGYanling1，LIUJianhua1，YANGBingtian3，YANGPeng3

(1.ProcessControlResearchCenterofTraditionalChineseMedicineofShandongAcademyofSciences，ShandongAnalysisandTestCenter，KeyLaboratoryforAppliedTechnologyofSophisticatedAnalyticalInstrumentsofShandongProvince，Jinan250014，China2.CollegeofFoodScienceandEngineering，ShandongAgriculturalUniversity，Taian271018，China3.JinanSanfengBioengineeringTechnologyCompany，Jinan251400，China)

Objective：A quantitative high performance liquid chromatography(HPLC)fingerprinting method had been used for the quality evaluation and discrimination ofScutellariabaicalensisGeorgi.MethodsThe chromatographic fingerprints were determined by injecting 5 μL of the sample solution each time on C18column(Agilent ZORBAX SB-C18column)with the gradient elution solvent system composed of 20 mmol·L-1HCOONH4+1% HCOOH and acetonitrile.The flow rate was 0.8 mL·min-1，the column temperature was maintained at 25 ℃ and the signals were acquired at 274 nm.ResultsIt was indicated that the developed HPLC method was simple，accurate and reliable for the development ofS.baicalensisfingerprint.The HPLC fingerprinting for ten batches samples tested contained the same seventeen peaks，and it could be used to discriminate different origins ofS.baicalensissamples combined with similarity analysis.ConclusionThe HPLC fingerprinting technique is an important tool in identification and quality evaluation ofS.baicalensis.

ScutellariabaicalensisGeorgi；HPLC；Quantitative fingerprint

國家重大新藥創(chuàng)制——中藥大品種腦心通膠囊技術(shù)改造研究(2011ZX09201-201-26)；山東省自然基金(ZR2013HL029)；山東省科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目[科基合字(2012)第15號]；山東省科技攻關(guān)計(jì)劃(2011GSF11908)

*

王曉，博士，研究員，研究方向：中藥質(zhì)量控制及資源；Tel：(0531)82605319，E-mail：wangx@sdas.org

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.003

2013-10-17)