干細胞輔助脂肪移植的臨床試驗進展分析

常 鵬， 黃 威， 王 飏， 邱 濤， 時 杰， 梁久龍， 王洪一， 張 倩， 陶 凱， 劉曉燕

綜 述

干細胞輔助脂肪移植的臨床試驗進展分析

常 鵬， 黃 威， 王 飏， 邱 濤， 時 杰， 梁久龍， 王洪一， 張 倩， 陶 凱， 劉曉燕

脂肪來源干細胞； 自體脂肪移植； 干細胞輔助脂肪移植； 臨床試驗

20世紀，自體脂肪組織移植已經(jīng)應用于人體軟組織缺損的重建。在傳統(tǒng)的脂肪組織移植中，平均吸收率為25%～80%[1]。影響移植脂肪組織吸收率的因素包括：移植脂肪細胞的活性及純度、受區(qū)的血供情況、移植脂肪組織的數(shù)量和體積等。因為脂肪細胞耐受缺氧能力差，所以在移植的初始階段，受區(qū)血液供應(毛細血管系統(tǒng))沒有建立，多數(shù)脂肪細胞在最初的48 h內(nèi)發(fā)生變性和壞死。近年的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)能夠耐受缺氧，在缺氧條件刺激下,可分泌多種細胞因子，發(fā)揮促血管生成作用和趨化作用，從而提高脂肪細胞的成活率；同時，ADSCs還可以向脂肪細胞分化。因此，應用干細胞輔助脂肪移植(cell-assisted lipotransfer， CAL)可以提高移植脂肪的成活率[2-7]。

動物實驗研究證實，在ADSCs輔助下，移植脂肪細胞的成活率可顯著提高，而相關(guān)的臨床試驗則開展較少，其主要原因是倫理學方面的限制；另外，試驗方法、試驗程序、試驗條件的不同，也導致結(jié)論差別較大。因此，對目前已經(jīng)開展的為數(shù)不多的CAL臨床試驗進行總結(jié)，能夠在科研思路、試驗設(shè)計和試驗操作上，為進一步的研究提供有價值的借鑒。筆者以“adipose-derived stem cells”“clinical trial”為檢索詞，在PubMed數(shù)據(jù)庫模糊檢索近5年文獻，共23篇，并追蹤日本Yoshimura團隊和丹麥Kolle團隊發(fā)表的系列文章。現(xiàn)總結(jié)分析如下。

1 日本Yoshimura團隊的相關(guān)試驗

CAL的臨床應用必須以試驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，然而，許多問題還在探索中，如移植的體積、供區(qū)的選擇、培養(yǎng)ADSCs的最佳濃度、細胞因子的添加等。在相關(guān)的臨床試驗中，日本Yoshimura團隊開展的較早且較為系統(tǒng)，而丹麥Kolle團隊實施的第1例臨床隨機雙盲對照試驗最具說服力。

2006年，Matsumoto等[8]分離由患者腹部吸脂獲得的脂肪，提取出基質(zhì)血管成分(stromal vascular fraction， SVF)，與脂肪細胞混合，移植于裸鼠背部一側(cè)皮膚；另一側(cè)移植相同體積的脂肪，4周后，切取兩側(cè)脂肪包塊進行對比。結(jié)果顯示，CAL使移植脂肪的成活率提高了35%以上。該實驗還應用免疫熒光、組織學檢測等方法進行了分析，為下一步臨床試驗打下了基礎(chǔ)。

Yoshimura等[9]以相同技術(shù)提取SVF(內(nèi)含ADSCs)，應用于40例隆乳患者。獲取的脂肪一半用來提取SVF，與另一半脂肪細胞混合注射到雙側(cè)乳腺內(nèi)，平均注射270 ml，2個月后，MRI和鉬靶射線評估存留脂肪的體積為100～200 ml。因該試驗的結(jié)果受到操作技術(shù)的影響，缺乏有效的隨機雙盲對照，只能初步說明在ADSCs輔助下，移植脂肪有可能獲得更高的成活率。

2008年，Yoshimura等[10]選取6例面部脂肪填充患者，3例應用CAL，3例應用傳統(tǒng)脂肪移植。隨訪9～13個月，注射體積50～250 ml，結(jié)果表明，應用CAL的患者效果更好。雖然該試驗在設(shè)計上不夠完善，評估的方法也為主觀評估，但從技術(shù)上進一步驗證了從腹部吸脂產(chǎn)物中提取SVF的過程，為后續(xù)開展臨床試驗積累了經(jīng)驗。

2010年，Yoshimura等[11]再次對15例CAL隆乳患者進行了評估，隨訪時間為12個月，應用新型的3D立體成像技術(shù)評估乳腺體積的變化。平均注射體積為264 ml，1年后，左側(cè)乳腺剩余脂肪體積為(143±80) ml；右側(cè)乳腺剩余脂肪體積為(155±50) ml。研究得出結(jié)論，CAL是簡便、安全、有效的方法。該試驗在成熟的CAL技術(shù)基礎(chǔ)上，引進了新型的3D立體成像技術(shù)作為評估手段，其優(yōu)點是簡便、無創(chuàng)，但其精確度與磁共振相比則稍差。同時，與前幾次試驗相比，其改進之處是延長了隨訪時間 ，這樣能夠更加科學地評價移植脂肪體積的變化。但是，本試驗在設(shè)計上缺乏對照組，未能科學、嚴謹?shù)胤磻獑栴}。

Yoshimura團隊一直致力于ADSCs相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究。2011年，Eto等[12]發(fā)現(xiàn)了脂肪細胞損傷因子(adipose injury cocktail， AIC)能夠激活ADSCs，使其發(fā)生定向分化及分泌細胞因子；2013年，Doi等[13]發(fā)明了利用黏貼法提取干細胞的裝置，并取得成功。該裝置含有人造纖維和聚乙烯纖維，能夠在吸脂過濾液中，將ADSCs黏附于表面而分離出來。這一技術(shù)大大提高了ADSCs的獲取率(圖1)。雖然其臨床試驗沒有達到嚴謹?shù)膶Ρ?，但是仍為其臨床應用提供了有價值的數(shù)據(jù)。

2 丹麥Kolle團隊的相關(guān)臨床試驗

2012年，丹麥Kolle團隊[14]在查閱大量關(guān)于CAL的基礎(chǔ)和臨床試驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，撰寫了綜述。該綜述詳盡分析了目前已經(jīng)發(fā)表的4篇大鼠脂肪移植實驗和3篇人體脂肪移植試驗在設(shè)計及評價方法上的優(yōu)點與不足。并于2013年在《Lancet》雜志發(fā)表了世界第1例關(guān)于CAL的人體單中心、隨機雙盲對照試驗[15]。該試驗在丹麥哥本哈根醫(yī)學中心進行，試驗周期為121 d，而選擇121 d作為評估期限，是考慮到移植脂肪一般在3個月后體積趨于穩(wěn)定。 試驗流程見圖2。

2.1 志愿者入組 共有13名入組的志愿者，男性2名，女性11名。志愿者排除條件包括：慢性疾病、吸煙、腹部手術(shù)史(不包括小切口的腹腔鏡手術(shù))、孕期(1年內(nèi)計劃懷孕)、哺乳期、常規(guī)麻醉藥物過敏、拒絕簽署知情同意書。志愿者中途退出試驗的情形包括：在細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染及其他并發(fā)癥。每個步驟由2名專家進行評估。

13名志愿者中，3名中途退出，最終10人完成全部試驗。試驗早期有1名男性和1名女性志愿者退出，原因是細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染；后期有1名女性志愿者退出，原因是移植物過于接近肱二頭肌內(nèi)側(cè)頭，影響靜脈回流，出現(xiàn)輕度并發(fā)癥。剩余10名志愿者平均年齡28.4歲，平均BMI 24.7。

2.2 試驗設(shè)計 選擇腹部作為吸脂供區(qū)，雙側(cè)上臂后部作為移植脂肪受區(qū)；一側(cè)上臂注射添加ADSCs的脂肪組織(ADSCs組)，另一側(cè)則注射單純脂肪(對照組)，按照隨機量表進行分組，并進行嚴格的隨機保密操作。

2.3 試驗結(jié)果 每名志愿者平均獲取7.50 ml(8.58×108)ADSCs，ADSCs組注射的富含ADSCs的脂肪組織容量平均為28.20 ml，對照組注射的單純脂肪容量平均為28.60 ml。除了1名志愿者,其他志愿者均未在脂肪吸取和移植過程中出現(xiàn)并發(fā)癥,在移植后的24 h內(nèi),所有志愿者均出現(xiàn)輕度紅腫，并很快恢復。

圖1 干細胞自動分離裝置 a.裝置外形結(jié)構(gòu)(左圖)，放大的內(nèi)部無紡布人造絲和聚乙烯織物結(jié)構(gòu)(右圖) b.工作原理及分離液走向(1混合成分流入，ADSCs成分因攜帶陽極電荷被吸附于纖維結(jié)構(gòu)上，剩余陰極電荷細胞由下口流出；2反向沖洗后獲得陽極電荷細胞；3沖洗口沖出雜質(zhì))圖2 CAL隨機雙盲對照試驗流程圖

MRI脂肪體積評估結(jié)果顯示，ADSCs組最初移植容量平均為28.38 ml,對照組為28.84 ml,這與注射的脂肪組織容量相吻合。脂肪移植后第121天,ADSCs剩余脂肪容量為23.00 ml(80.9%),對照組為4.66 ml (16.3%)。移植脂肪組織切除后，進行組織學評估，包括：移植脂肪組織的分布、連接、新生連接、壞死、新生血管密度及分布，安全性及可行性。結(jié)果顯示，ADSCs組與對照組所含ADSCs比例分別為 84.3%和67.0%；新形成的連接組織比例分別為5.3%和0.5%；細胞壞死率分別為4.6%和16.1%；正常連接組織比例分別為5.7%和16.4%；血管密度分別為20.86 /mm2和26.32 /mm2。

2.4 結(jié)果分析 該試驗一經(jīng)發(fā)表，便受到科學界的廣泛關(guān)注。其結(jié)果與目前其他一些試驗有較大出入，其原因可能為：在ADSCs提取的過程中，涉及到臨床操作和實驗室操作兩部分，而且沒有統(tǒng)一的標準；臨床醫(yī)師操作經(jīng)驗的差異；是否對脂肪細胞做了有效的保護等。但是，這一級別較高的循證醫(yī)學證據(jù)，為下一步的臨床應用提供了非常有價值的依據(jù)。

3 總結(jié)與展望

目前，關(guān)于CAL的臨床試驗，還沒有循證醫(yī)學的薈萃分析證據(jù)，只有1篇隨機雙盲對照試驗結(jié)論。筆者在PubMed進行模糊檢索近5年文獻，23篇，并追蹤日本Yoshimura團隊和丹麥Kolle團隊的系列文章8篇，其中還包括2013年在《Lancet》雜志發(fā)表的世界第1例CAL隨機雙盲對照試驗[15]。雖然結(jié)論上有很大差異，但通過分析發(fā)現(xiàn)，部分原因是由于操作及試驗條件的差別，從而導致臨床結(jié)論的差異。但目前的研究結(jié)果傾向于ADSCs輔助脂肪移植的效果優(yōu)于傳統(tǒng)的脂肪移植。因此，未來關(guān)于CAL的臨床試驗，應該更加關(guān)注試驗的設(shè)計，實施中應符合公認標準，同時也鼓勵進行多中心的隨機對照試驗，為進一步臨床應用提供理論支持。

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10.3969/j.issn.1673-7040.2014.10.015

2014-07-17)

遼寧省科學技術(shù)計劃項目基金資助(2012225014)

110064 遼寧 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形科(常 鵬，黃 威，王 飏，邱 濤，時 杰，梁久龍，王洪一，張 倩，陶 凱，劉曉燕)；第二軍醫(yī)大學(常 鵬,劉曉燕)

常 鵬(1982-)，男，遼寧沈陽人，主治醫(yī)師，博士.

陶 凱，110064,沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形科，電子信箱:tkzx123@163.com；劉曉燕，110064,沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形科，電子信箱：lxyzx123@163.com