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    四氫嘧啶羥化酶的研究進(jìn)展

    2014-10-27 09:04:56張慶王青青鞠建松徐書(shū)景
    生物技術(shù)通訊 2014年5期
    關(guān)鍵詞:羥化酶殘基嘧啶

    張慶,王青青,鞠建松,徐書(shū)景

    河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 石家莊 050024

    近年來(lái),四氫嘧啶(ectoine,E)及其衍生物5-羥化四氫嘧啶(hydroxyectoine,HE)在微生物細(xì)胞中作為滲透相溶性物質(zhì)已被廣泛研究,它們不僅具有與其他相容性物質(zhì)(如甜菜堿、糖、氨基酸及其衍生物、多元醇等)相同的滲透調(diào)節(jié)作用,還具有在冷凍、高溫、干燥及氧自由基環(huán)境中保護(hù)細(xì)胞膜、維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的性能[1-2]。雖然四氫嘧啶和5-羥化四氫嘧啶在結(jié)構(gòu)上密切相關(guān),作用方面也有很多相似之處,但最近的研究顯示5-羥化四氫嘧啶對(duì)蛋白的保護(hù)作用要優(yōu)于四氫嘧啶和其他相溶性物質(zhì)[3]。

    目前5-羥化四氫嘧啶已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、生物制造、化工等行業(yè)[4]。有研究發(fā)現(xiàn),5-羥化四氫嘧啶不僅可以加入藥物中用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療,也可作為化療時(shí)健康細(xì)胞的保護(hù)劑[5]。Harishchan?dra等發(fā)現(xiàn),5-羥化四氫嘧啶還具有增強(qiáng)人工肺表面活性劑的作用[6]。此外,5-羥化四氫嘧啶還能提高雙鏈DNA的解鏈溫度,可以作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的增強(qiáng)劑[7]。

    四氫嘧啶羥化酶(ectoine hydroxylase,EctD)主要負(fù)責(zé)將四氫嘧啶羥基化,轉(zhuǎn)化為5-羥化四氫嘧啶,屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴(lài)性的雙加氧酶超家族(EC 1.14.11)[8-9]。自從發(fā)現(xiàn)EctD以來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)EctD產(chǎn)生菌做了廣泛研究。李巖等從極端耐鹽放線菌中克隆獲得5-羥基四氫嘧啶合成相關(guān)基因ectABCD,并分析了這些基因?qū)暝诟啕}脅迫中的作用[10];Reuter等從需鹽枝芽孢桿菌(Virgibacil?lus salexigens)中克隆獲得目的基因ectD,并對(duì)其蛋白晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理進(jìn)行了解析[11]。我們將就EctD的基因來(lái)源、功能、結(jié)構(gòu)及活性中心等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合分析。

    1 四氫嘧啶羥化酶的來(lái)源

    擁有ectD基因的微生物在生理、生活方式和棲息地分類(lèi)上相對(duì)多樣化,它們中有的來(lái)自病原菌,如膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)和波氏桿菌屬(Bordetella)的多個(gè)菌株;有的來(lái)自在抗生素生產(chǎn)方面具有重要作用的微生物,如天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)和灰色鏈霉菌(S.griseus);有的是生長(zhǎng)在極低或極高溫度環(huán)境中的細(xì)菌,如嗜熱芽孢桿菌(Geobacillus sp.Y412MC10)和嗜冷鞘脂單胞菌(Sphingopyxis alaskensis),以及生長(zhǎng)在極端pH環(huán)境中的細(xì)菌,如歐氏堿湖生菌(Alkalilimnicola ehrlichei);大部分擁有ectD基因的微生物生長(zhǎng)在高鹽或海洋環(huán)境中,如海洋細(xì)菌泊庫(kù)島食烷菌(Alca?nivorax borkumensis SK2)[11]。

    Bursy等通過(guò)氨基酸序列比對(duì)檢索發(fā)現(xiàn),有46株革蘭陽(yáng)性或陰性菌的EctD與需鹽枝芽孢桿菌的EctD的氨基酸同源性高達(dá)61%~73%,其中ectD基因位于ectABC基因簇下游的有30種,而剩余的16株中ectD基因并不與ectABC基因相連[9]。ectD基因片段的大小隨菌株來(lái)源不同而不等,一般約為1 kb,如來(lái)自需鹽色鹽桿菌(Chromohalobacter salexigens)的 ectD-1基因?yàn)?996 bp(GenBank:ABE60347.1),ectD-2基因?yàn)?942 bp(GenBank:ABE57904.1),而來(lái)源于需鹽枝芽孢桿菌的ectD基因?yàn)?00 bp(Gen?Bank:AAY29689.1)[11]。盡管不同來(lái)源的EctD的氨基酸序列同源性有所不同,但它們的保守位點(diǎn),如與2-酮戊二酸及Fe2+的結(jié)合位點(diǎn)基本相同(圖1),說(shuō)明ectD基因在進(jìn)化上是相對(duì)保守的[1-11]。

    序列同源性比對(duì)檢索發(fā)現(xiàn),ectD與脯氨酸羥化酶基因、人類(lèi)植烷酸-輔酶A羥化酶(phytanoyl-CoA hydroxylase,PhyH)基因具有較高的同源性,同屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴(lài)性的雙加氧酶超家族,都存在結(jié)合Fe2+的保守2-His-1-羧酸酯面三聯(lián)體[9]。不同來(lái)源的EctD與指孢囊菌RH1中L-脯氨酸-4-羥化酶(GenBank:D78338.1)的氨基酸序列同源性為26%~32%[12]。由于以上原因,ectD基因常被誤認(rèn)為脯氨酸羥化酶基因或植烷酸-輔酶A羥化酶基因[2]。

    2 四氫嘧啶羥化酶的催化反應(yīng)機(jī)理

    EctD屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶,該家族的酶普遍存在于原核和真核微生物中,能催化多種氧化反應(yīng),包括環(huán)化反應(yīng)、環(huán)碎裂、C-C鍵斷裂、降低氧飽和度、鹵化及羥化反應(yīng)等[13-14]。在四氫嘧啶羥基化反應(yīng)中,共底物2-酮戊二酸脫去羧基釋放一個(gè)CO2分子從而形成琥珀酸,同時(shí),氧分子中的一個(gè)氧原子被納入琥珀酸鹽,而另一個(gè)氧原子形成羥基插入四氫嘧啶從而形成5-羥化四氫嘧啶[9]。

    3 四氫嘧啶羥化酶的活性檢測(cè)方法

    目前EctD的活性檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法(HPLC)[15]。四氫嘧啶及羥化四氫嘧啶的檢測(cè)以乙腈/水(80/20,V/V)為流動(dòng)相,流速為1.0 mL/min,在210 nm處檢測(cè)吸收峰[16]。底物四氫嘧啶及產(chǎn)物羥化四氫嘧啶可以采用C18柱通過(guò)紫外檢測(cè)器直接檢測(cè)[17],也可以通過(guò)Fmoc-Cl柱前衍生,采用NH2柱通過(guò)熒光檢測(cè)器檢測(cè)[15],根據(jù)底物和產(chǎn)物的峰面積計(jì)算EctD的催化效率[9]。

    雖然EctD的來(lái)源很廣,但其催化條件基本相似,催化過(guò)程中都需要氧氣(劇烈振蕩)、FeSO4、α-酮戊二酸及L-抗壞血酸。Bursy等發(fā)現(xiàn)催化反應(yīng)中僅需要低濃度的FeSO4和抗壞血酸,F(xiàn)eSO4濃度超過(guò)1 mmol/L會(huì)對(duì)EctD的活性產(chǎn)生抑制作用,同樣,5 mmol/L抗壞血酸對(duì)EctD的活性抑制作用達(dá)70%,而加入過(guò)氧化氫酶則有利于提高酶催化活性,加入1.3 kU的過(guò)氧化氫酶可使酶蛋白的催化效率提高5倍[9]。Bursy等對(duì)來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor)A3(2)和需鹽枝芽孢桿菌的EctD的酶學(xué)特性進(jìn)行了表征,分析表明二者的催化條件基本相似,對(duì)底物四氫嘧啶和2-酮戊二酸的親和常數(shù)Km也基本相當(dāng)[8]。

    將四氫嘧啶的2種衍生物,五元環(huán)化合物[(RS)-4,5-dihydro-2-methyl-imidazole-4-carbox?ylic acid]及七元環(huán)化合物homoectoine[(S)-4,5,6,7-tetrahydro-2-methyl-1H-(1,3)-diazepine-4-carboxylic acid]作為底物,經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有得到其羥化產(chǎn)物,說(shuō)明EctD具有高度的底物專(zhuān)一性,僅對(duì)四氫嘧啶(六元環(huán)化合物)具有催化活性[9]。

    圖1 四氫嘧啶羥化酶與脯氨酸羥化酶的同源序列比對(duì)(部分)

    4 四氫嘧啶羥化酶的空間結(jié)構(gòu)

    雖然EctD廣泛存在于各種革蘭陰性和陽(yáng)性細(xì)菌中,其產(chǎn)物5-羥化四氫嘧啶作為相溶性物質(zhì)也被廣泛研究,但有關(guān)EctD空間結(jié)構(gòu)的報(bào)道卻很少。目前僅有來(lái)自需鹽枝芽孢桿菌的EctD蛋白結(jié)構(gòu)得到解析(PDB no.3EMR)[11]。從解析的結(jié)構(gòu)來(lái)看,EctD蛋白以單體形式存在,與其他非血紅素鐵(Ⅱ)和2-酮戊二酸依賴(lài)性雙加氧酶的成員一樣,其蛋白結(jié)構(gòu)的核心部分由雙鏈β-螺旋和一些穩(wěn)定的α-螺旋組成。它由鏈β-Ⅰ、β-Ⅱ、β-Ⅲ、β-Ⅳ、β-Ⅴ、β-Ⅵ、β-Ⅶ和β-Ⅷ組成,其中β-Ⅱ、β-Ⅳ、β-Ⅴ和β-Ⅶ形成曲折的片段,組成所謂的短鏈,而主要片段則由β-I、β-Ⅲ、β-Ⅵ和β-Ⅷ組成。EctD中的主要片段兩側(cè)的延伸由反平行鏈β-2、β-3和β-4組成。

    4.1 Fe2+結(jié)合位點(diǎn)

    非鐵紅素和2-酮戊二酸依賴(lài)性的雙加氧酶家族的酶促功能主要取決于高度活潑的鐵離子。在需鹽枝芽孢桿菌EctD的活性中心,氨基酸殘基His146、Asp148和His248的功能基團(tuán)(2個(gè)咪唑基團(tuán)和1個(gè)羧基基團(tuán))與Fe2+結(jié)合形成所謂的2-His-1-羧酸酯面三聯(lián)體[11-18]。Widderich等將這些位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后,不僅導(dǎo)致突變體蛋白H146A、D148A和H248A完全喪失了酶學(xué)活性,而且在突變體蛋白中也不再含有鐵離子,與之相反的是,每摩爾野生型EctD中含有0.9 mol的鐵離子,這些結(jié)果證明氨基酸殘基His146、Asp148和His248是酶蛋白結(jié)合鐵離子及酶活性所必需的[18]。

    4.2 2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)

    在所有含非還原性亞鐵離子和2-酮戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶中,共底物2-酮戊二酸結(jié)合于酶蛋白活性中心底部,并通過(guò)其1-羧基基團(tuán)和2-氧代基團(tuán)參與協(xié)調(diào)亞鐵離子與酶的結(jié)合,其5-羧基基團(tuán)則通過(guò)與精氨酸或賴(lài)氨酸的側(cè)鏈堿性基團(tuán)形成的鹽橋及與氨基酸殘基的羥基形成氫鍵而穩(wěn)定結(jié)合[18-19]。

    由于至今還沒(méi)有得到EctD與2-酮戊二酸的復(fù)合物晶體,2-酮戊二酸與EctD的結(jié)合位點(diǎn)只能通過(guò)比較EctD的配體結(jié)合口袋及其他雙加氧酶的結(jié)構(gòu)來(lái)推測(cè)。McDonough等對(duì)與EctD最接近的PhyH蛋白結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),Ser266的羥基基團(tuán)與2-酮戊二酸相互作用[20];通過(guò)對(duì)71個(gè)EctD類(lèi)蛋白序列比對(duì),Ruter等發(fā)現(xiàn)需鹽枝芽孢桿菌來(lái)源的EctD中Ser250位點(diǎn)與PhyH中Ser266位點(diǎn)相對(duì)應(yīng),該位點(diǎn)嚴(yán)格保守,位于與亞鐵離子螯合的His248之后,Ruter等推測(cè)EctD中Ser250的醇羥基可能與2-酮戊二酸的5-羧基基團(tuán)相互作用[11]。隨后,Widderich等通過(guò)對(duì)185個(gè)EctD類(lèi)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)及PhyHD1A(PDB no.2OPW)和2-酮戊二酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)信息,發(fā)現(xiàn)EctD中氨基酸位點(diǎn)Arg259、Ser250和Phe143與PhyHD1A中2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)應(yīng),將這些位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后均導(dǎo)致酶蛋白活性喪失,說(shuō)明EctD中2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)由 Arg259、Ser250和 Phe143構(gòu)成[18]。此外,Wid?derich等發(fā)現(xiàn),除了上述與2-酮戊二酸結(jié)合的3個(gè)位點(diǎn)外,Arg131也和2-酮戊二酸分子存在相互作用,其側(cè)鏈與Phe95及Asn133的側(cè)鏈形成陽(yáng)離子-π相互作用,從而使其穩(wěn)定存在于結(jié)合配體的孔穴之中,起到了維持EctD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用,一旦失去了這個(gè)相互作用就會(huì)導(dǎo)致EctD活性中心更加開(kāi)放,導(dǎo)致酶蛋白不能結(jié)合底物。Widderich等將上述3個(gè)氨基酸位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后,所得突變體蛋白完全喪失了活性,證明這些位點(diǎn)和2-酮戊二酸之間存在相互作用[18]。因此,可以說(shuō)EctD中2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)由Arg259、Ser250、Phe143、Arg131、Asn133和 Phe95構(gòu)成。

    4.3 四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)

    同樣,由于至今還沒(méi)有得到EctD與底物(四氫嘧啶)或產(chǎn)物(5-羥化四氫嘧啶)的復(fù)合物晶體,底物和EctD的結(jié)合位點(diǎn)尚無(wú)法確定[11]。Widderich等通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)(molecular dynamics simula?tions)對(duì)需鹽枝芽孢桿菌來(lái)源的EctD分析發(fā)現(xiàn),四氫嘧啶位于由氨基酸殘基 Gln129、Trp152、Ser165、Phe242和Phe263組成的口袋中,其與各氨基酸殘基側(cè)鏈間的距離為5~6 ?;此外,四氫嘧啶的甲基基團(tuán)指向位于口袋底部的Ser130的主鏈(甲基基團(tuán)與Ser130的Cα間的距離小于5 ?),其羧基基團(tuán)和Ser165的側(cè)鏈形成氫鍵(二者間距離小于3.2 ?),并導(dǎo)致四氫嘧啶分子的脒基和殘基Gln129側(cè)鏈以氫鍵結(jié)合;而從185個(gè)EctD類(lèi)蛋白序列比對(duì)結(jié)果可以看出,上述6個(gè)氨基酸位點(diǎn)均高度保守。因此,Widderich等推測(cè)這些氨基酸殘基可能是酶蛋白EctD的底物結(jié)合位點(diǎn)[18]。

    為了證實(shí)四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果,Widd?erich等構(gòu)建了一系列定點(diǎn)突變體:將氨基酸殘基Gln129、Trp152、Phe242和 Phe263分別突變?yōu)?Ala,所獲得的突變體酶蛋白的活性均完全喪失,而Ser165突變?yōu)锳la僅使酶蛋白的活性功能受到較大程度的限制;進(jìn)一步將Trp152突變?yōu)镻he或Tyr后,突變體同樣失去了蛋白活性,這個(gè)結(jié)果和通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬所構(gòu)建的模型相一致,說(shuō)明四氫嘧啶分子與Trp152側(cè)鏈上的苯環(huán)相互作用,氨基酸置換使該位點(diǎn)側(cè)鏈?zhǔn)ケ江h(huán)后導(dǎo)致突變體蛋白無(wú)法和四氫嘧啶結(jié)合,從而使蛋白喪失活性。同樣,將Phe242和Phe263突變?yōu)門(mén)yr后導(dǎo)致突變體酶蛋白活性大幅下降,而突變?yōu)門(mén)rp后則活性完全喪失,說(shuō)明四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)不能進(jìn)行較大的結(jié)構(gòu)上的修改,尤其是插入含有大體積側(cè)鏈的色氨酸殘基。Widderich等還對(duì)一些側(cè)鏈遠(yuǎn)離酶蛋白催化中心或伸向cupin桶狀結(jié)構(gòu)但并不與配體相互作用的氨基酸殘基進(jìn)行突變,如位于柔性loop區(qū)域的Pro198和Ser205等,這些位點(diǎn)突變后突變體酶蛋白仍然保持活性。由此可以說(shuō)明氨基酸殘基Gln129、Ser130、Ser165、Trp152、Phe242及 Phe263是與底物四氫嘧啶相結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)[18]。

    5 展望

    EctD的催化產(chǎn)物5-羥化四氫嘧啶作為相容性物質(zhì)已受到廣泛關(guān)注,它存在于很多細(xì)菌中,提高細(xì)胞內(nèi)的水活度,維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡,保證細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)[16]。Rodríguez-Moya等將需鹽色鹽桿菌四氫嘧啶合成基因簇ectABC和ectD串聯(lián)表達(dá),提高了5-羥化四氫嘧啶的生成量,細(xì)胞對(duì)許多環(huán)境刺激因素(高鹽、溫度、鐵離子、外部滲透劑、DNA促旋酶抑制劑萘啶酸等)的耐受性也得到了提高[21]。目前,利用EctD轉(zhuǎn)化生成5-羥化四氫嘧啶也受到科研工作者的重視。Eilert等將伸長(zhǎng)鹽單胞菌(Halomonas elongata)中5-羥化四氫嘧啶合成基因簇ectA、ectB、ectC和ectD插入漢遜酵母(Hansenula polymorpha)基因組后,所構(gòu)建工程菌株的5-羥化四氫嘧啶轉(zhuǎn)化率接近100%,發(fā)酵液中產(chǎn)物達(dá)到2.8 g/L[22]??梢钥闯?,目前在EctD的開(kāi)發(fā)利用方面得到了比較充分的研究。不過(guò),有關(guān)該酶的空間結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理方面的研究還比較少,迄今僅有來(lái)自需鹽枝芽孢桿菌的EctD晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理得到了解析和研究,這方面的工作還有待進(jìn)一步完善。此外,可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將ectD基因插入工程菌株或轉(zhuǎn)基因植物中,以提高工程菌株和轉(zhuǎn)基因植物對(duì)高鹽、高溫、干燥、冰凍等環(huán)境刺激因素的耐受性。

    EctD和脯氨酸羥化酶都屬于Fe2+、2-酮戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶超家族,相互間序列同源性較高,與底物及配體的結(jié)合位點(diǎn)高度保守,Widderich等將脯氨酸羥化酶歸類(lèi)于EctD類(lèi)酶蛋白[18],因此,我們推測(cè)二者或許具有相似的催化功能。由于羥脯氨酸可作為各種軟組織疾病的藥物,還可加快傷口愈合,治療各種皮膚疾病,它還是合成多種藥物的原料,如第三代抗生素,抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等,因此,羥脯氨酸的生物合成具有廣闊的發(fā)展前景[23-24]。但是,由于當(dāng)前采用的脯氨酸羥化酶主要來(lái)自指囊孢菌,該酶基因中的GC含量過(guò)高(73.9%),影響酶蛋白的可溶性表達(dá),且該酶的催化活性低,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),產(chǎn)率較低,不利于工業(yè)化生產(chǎn)[23]。本實(shí)驗(yàn)室從鹽湖樣品中克隆獲得了一個(gè)ectD基因,所編碼酶蛋白以可溶性形式大量表達(dá),活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該酶具有微弱的羥脯氨酸轉(zhuǎn)化能力;參照已解析的EctD和脯氨酸羥化酶三維結(jié)構(gòu)信息,分析酶蛋白的活性中心及配體結(jié)合位點(diǎn),通過(guò)基因工程技術(shù)合理改造EctD,以獲得可溶性好且對(duì)脯氨酸催化效率高的理想酶蛋白。

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