一種新的海洋微藻病毒絲氨酸蛋白酶基因的克隆表達及其活性分析

李麗華，邱健健，蔡藝欽，于鵬，劉靜雯＊

（1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門361021；2.福建省高校食品微生物與酶工程技術研究中心，福建 廈門361021）

1 引言

海洋微藻類病毒廣泛分布于自然海域。病毒的裂解是導致浮游植物死亡和種群數(shù)量減少的主要因素之一，并控制著浮游植物群落的多樣性和豐度［1］。病毒和宿主在不斷相互作用過程中，通過相互競爭并協(xié)同進化以防止自身的滅亡［2］。從阻止病毒DNA的注入到干擾病毒DNA的復制、RNA轉(zhuǎn)錄以及子代病毒的形成，宿主進化出了一系列的防御機制來破壞病毒的感染系統(tǒng)。相應地，為了實現(xiàn)自身的最大增殖，病毒也形成許多策略逃避宿主的防御系統(tǒng)，如在感染宿主后，病毒將自身基因組攜帶的基因或是從上個宿主細胞中獲得的基因整合到宿主基因組中——即基因橫向轉(zhuǎn)移，這些基因表達的蛋白能夠阻止宿主細胞凋亡、抑制細胞內(nèi)激酶的降解、刺激細胞生長，從而為自身復制創(chuàng)造便利條件［1，3］。

海洋球石藻Coccolithophores是一類生活于海洋中的單細胞微型浮游植物，廣泛分布在世界范圍的近海和大洋水域中，尤其是亞極地較高緯度海區(qū)的優(yōu)勢種類，也是該海域典型的赤潮種。大量研究證實病毒感染是終止球石藻Emilianiahuxleyi赤潮的一個重要因素［4］。目前已分離到十多株海洋球石藻病毒，均為雙鏈DNA病毒，已被確定為雙鏈DNA病毒科中的一個新屬——Coccolithovirus［5—6］。對海洋球石藻病毒（E.huxleyivirus）Eh V86基因組測序注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因組包含472個編碼基因，其中85%的基因被預測為編碼膜蛋白，但其確切功能未知，僅有約14%的基因在數(shù)據(jù)庫中具有功能歸屬［7］。該病毒編碼的功能基因主要包括：參與細胞氧化還原反應的硫氧還蛋白（Trx）基因、構成病毒顆粒的基本組成單元的主要外殼蛋白（MCP）基因和介導鞘脂類物質(zhì)代謝的鞘脂類物質(zhì)合成基因（SBP）等［7］。另外一些基因編碼的蛋白酶可能與病毒吸附、宿主識別、Caspase介導的凋亡途徑、信號級聯(lián)通路、活性氧的調(diào)控、成熟病毒組裝和釋放等功能緊密相關［7］。目前，在Eh V86基因組中，有5種被預測為編碼絲氨酸蛋白酶的基因，分別為ehv021、ehv361、ehv447、ehv151和ehv160，其中ehv021、ehv151和ehv160被預測為胰蛋白酶超家族［7—8］。微陣列分析這些基因的轉(zhuǎn)錄情況表明，除了ehv361外，所有病毒編碼的絲氨酸蛋白酶均在感染過程中表達［7—8］。但絲氨酸蛋白酶基因的表達與病毒感染之間的相互關聯(lián)尚不清楚。

絲氨酸蛋白酶（serine proteinase，Sp）是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，廣泛存在于動物、植物、細菌、病毒、真菌中，參與生命的各種反應如蛋白質(zhì)翻譯后的加工、細胞分裂、病原體感染、宿主的防御、組織降解及細胞凋亡等，它們通過對蛋白酶原的激活或抑制而起調(diào)節(jié)因子作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)ATP依賴的絲氨酸蛋白酶具有一個保守的生理功能，即作為分子伴侶，不僅起到水解的作用，還具有蛋白組裝及蛋白復合體降解等功能［10］，從而介導一系列控制熱激反應、噬菌體的生命周期和細胞程序性死亡（PCD）等過程的蛋白質(zhì)的降解［11—12］。有些致病性真菌在感染宿主過程中自身分泌的內(nèi)源性蛋白酶包含有絲氨酸蛋白酶以破壞宿主細胞正常的生理代謝功能，同時也刺激宿主應激性地產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶作為信號分子誘導宿主防御系統(tǒng)基因的表達，從而對抗病原菌的侵染［13］。海洋微藻類病毒與其宿主是否也存在類似的相互作用尚未見報道。目前報道的絲氨酸蛋白酶有很多，諸如參與植物器官衰老的植物絲氨酸蛋白酶［14］，也有利用基因工程技術克隆表達的微生物絲氨酸蛋白酶，如稻瘟病原菌絲氨酸蛋白酶［13］，以研究其結(jié)構與功能。

本研究以海洋球石藻E.huxleyi病毒Eh V99B1為研究對象。從Eh V99B1基因組中克隆Sp基因，對該基因序列進行系統(tǒng)的生物信息學分析，并于大腸桿菌中進行重組表達及活性分析，為進一步研究Eh V99B1－Sp在微藻病毒與宿主相互作用過程中的調(diào)節(jié)作用及其功能與應用奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 海藻和病毒

實驗用海洋球石藻Emilianiahuxleyi株系為Eh－BOF92；病毒株為Eh V99B1，均分離自挪威海域，由挪威卑爾根大學生物系Gunnar教授贈送。

2.1.2 菌種與試劑

TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、核酸內(nèi)切酶EcoR I和NotI均購自Ta Ka Ra公司產(chǎn)品，p MD19－T載體購自碧云天生物技術研究所，DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品，大腸桿菌菌株Top10、E.coilBL21和p ET32a表達載體均為本實驗室保存，瓊脂糖為西班牙進口分裝，測序由廣州英駿生物技術有限公司完成，鯉魚肌肉絲氨酸蛋白酶（MBSP）抗體由集美大學生物工程學院曹敏杰教師實驗室自制，其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

2.2 實驗方法

2.2.1 引物設計

根據(jù)GenBank上報道的Eh V86病毒基因組的絲氨酸蛋白酶序列，采用GeneDoc軟件和Primer Premier5.0軟件設計引物。本實驗所用引物為：

F∶5’－CGGAATTCATTTCAAGAGTATTGGCAGT CG－3’（劃線部分為EcoR I酶切位點）；R∶5’－ATTGCGGCCGCTTATTGTATGTGATTCGTT －3’（劃線部分為NotI酶切位點）。

2.2.2 病毒DNA的提取

采用CTAB法提取病毒基因組DNA［15］。

2.2.3 Eh V99B1－Sp基因的PCR擴增

以提取的病毒基因組DNA為模板，在25μL反應體系中（無菌dd H2O 7.5μL，Taq預混液12.5 μL，模板3μL，引物F和R各1μL）進行PCR，反應條件為：95℃預變性3 min，95℃ 30 s，50℃ 60 s，72℃90 s，擴增30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，使用DNA凝膠回收試劑盒回收。

2.2.4 感受態(tài)細胞的制備

制備方法參照《分子克隆實驗指南（第3版）》［16］。

2.2.5 Eh V99B1－Sp基因的克隆

（1）T克隆的構建

按照T載體：PCR產(chǎn)物＝1∶5～8的比例，取回收的PCR產(chǎn)物4μL，T載體1μL和T4DNA ligest solutionⅠ5μL混合，于16℃連接16 h。

（2）轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞

將10μL T克隆連接產(chǎn)物加入到200μL的感受態(tài)細胞中，冰浴30 min，42℃熱激90 s，冰浴2 min。加入到含有800μL LB培養(yǎng)基（1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%NaCl，p H 7.0）的試管中混勻，37℃培養(yǎng)1 h。取未離心菌液200μL涂布含氨芐青霉素（終濃度為0.1 mg／mL）的LB固體平板（1%蛋白胨，0.5%酵母提 取 物，1%NaCl，p H 7.0，預先涂有40μL 20 mg／mL的X－gal與4μL 200 mg／mL的IPTG），同時將剩余菌液于8 000 r／min離心1 min，分別取上清、沉淀各200μL涂布平板（同上），于37℃倒置培養(yǎng)約12 h。

（3）重組質(zhì)粒p MD19－T－Eh V99B1－Sp的篩選與鑒定

用滅菌的牙簽挑取白斑，接種于含有氨芐青霉素（終濃度0.1 mg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中37℃搖床上振蕩培養(yǎng)約12 h。質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切驗證，雙酶切采用20μL體系：10×H buffer 2μL，0.1%BSA 2μL，EcoRI 1μL，NotI 1 μL，重組質(zhì)粒14μL，37℃反應3.5 h，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；陽性克隆送至廣州英駿生物技術有限公司測序。

2.2.6 Eh V99B1－Sp生物信息學分析

利用DNAStar、Blast等軟件對測序結(jié)果進行分析并預測其一級結(jié)構；利用MEGA4.1分析軟件建立系統(tǒng)進化樹；然后再利用GeneDoc、Clustal X、Raswin等軟件和http／／www.expasy.ch／tools／protparam.html、http／／espript.ibcp.fr／ESPript／ESPript／index.php、http／／swissmodel.expasy.org等在線軟件對其二級和三級結(jié)構進行預測，并利用Ex PASy網(wǎng)站的Prot Scale程序分析蛋白疏水性結(jié)構（http：／／us.expasy.org／cgi－bin／protscale.pl）、蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構（http：／／www.ch.embnet.org／soft ware／TMPRED－for m.html）及信號肽區(qū)域（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Signal P／）。

2.2.7 p ET32a－Eh V99B1－Sp重組質(zhì)粒的構建

提取p MD19－T－Eh V99B1－Sp克隆質(zhì)粒和表達載體p ET32a，用EcoRI及NotI分別對p MD19－TEh V99B1－Sp克隆質(zhì)粒和表達載體p ET32a進行雙酶切，酶切產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，T4 DNA ligest sol ution I對回收產(chǎn)物進行連接（連接反應為10μL體系：回收目的基因4μL，p ET32a載體1μL，T4DNA ligest sol utionI 5μL，于16℃連接16 h）；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌Top10，提取質(zhì)粒，進行PCR和酶切鑒定；陽性重組表達質(zhì)粒（p ET32a－Eh V99B1－Sp）轉(zhuǎn)化E.coliBL21（過程同1.2.5.2），進行菌落PCR驗證（挑取固體平板上的單菌落，重懸于20μL無菌水中，100℃煮沸10 min，離心取上清；取3μL上清作為模板進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性3 min，95℃30 s，50℃60 s，72℃90 s，擴增30個循環(huán)，72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.2.8 重組菌株（BL21／p ET32a－Eh V99B1－Sp）的活性檢測

將陽性重組菌（BL21／p ET32a－Eh V99B1－Sp）和實驗對照菌株（BL21／p ET32a）分別接種于含有氨芐青霉素（終濃度0.1 mg／mL）的1%脫脂牛奶平板（包括1%脫脂奶粉，1%瓊脂溶于蒸餾水），37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落水解情況。

2.2.9 p ET32a－Eh V99B1－Sp在E.ColiBl21誘導表達

將陽性重組菌株（BL21／p ET32a－Eh V99B1－Sp）和實驗對照菌株（BL21／p ET32a）分別接種于含有氨芐青霉素（終濃度0.1 mg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中（包括1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%Na Cl，p H 7.0），37℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600達 到 0.7 左 右，從IPTG 濃度（0.3 mmol／L、0.5 mmol／L、0.8 mmol／L、1.0 mmol／L）、誘導溫度（18℃、25℃、30℃、37℃）和誘導時間（3 h、5 h、7 h、10 h、12 h）等三方面進行表達條件優(yōu)化，離心收集菌體并重懸于PBS中，超聲波破碎，4℃、12 000 r／min離心，將沉淀重懸于等體積的PBS中，分別取全細胞、上清和沉淀進行SDS－PAGE。

2.2.10 重組蛋白 Eh V99B1－Sp的純化和 Westernbloting檢測

經(jīng)IPTG誘導表達后的菌體經(jīng)超聲波破碎，4℃、15 000 r／min離心20 min，取上清過 Ni－NATagarose柱，用含250 mmol／L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白（參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱操作說明），SDS－PAGE檢測目的蛋白的純度。用 Western－bloting檢測目的蛋白的特異性，Western－bloting中所用的一抗為鯉魚肌肉絲氨酸蛋白酶（MBSP），稀釋比例1∶100，二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠Ig G，稀釋比例1∶200，用DAB顯色。

3 結(jié)果

3.1 Eh V99B1－Sp的擴增

以Eh V99B1基因組為模板，PCR擴增獲得大小約為1 110 bp的DNA片段（GenBank，登陸號：KC161207）。構建p ET32a－Eh V99B1－Sp重組表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，PCR和雙酶切鑒定結(jié)果如圖1。

圖1 Eh V99B1－Sp重組載體雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the digest product of the p ET32a－Sp recombinant plasmid Lane

3.2 Eh V99B1－Sp基因的分子生物學特征

3.2.1 Eh V99B1－Sp的同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育關系分析

多重同源性比對發(fā)現(xiàn)：該克隆片段與GenBank中Eh V86分離株（登陸號：NC＿007346）的同源性為95%，氨基酸序列的同源性為97%，而與其他物種的Sp氨基酸序列同源性僅為28%～32%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，Eh V之間的Sp自成一支且與Ctenocephalidesf elis貓櫛首蚤的距離最近，與其他種類從低級至高級越來越遠（見圖2）。

3.2.2 Eh V99B1－Sp生化特性和結(jié)構分析

用在線軟件分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)有368個氨基酸，相對分子量約為39.6 k Da，理論等電點（pI）為6.255，其包含36個堿性氨基酸，33個酸性氨基酸，115個疏水性氨基酸，128個極性氨基酸?？缒そY(jié)構分析該蛋白是一個二次跨膜蛋白，具有典型的LTAGHC（組氨酸活性位點區(qū)域）和AICNGDSGGPLF（絲氨酸活性位點區(qū)域）兩個絲氨酸蛋白酶水解催化活性位點的氨基酸基序；其二級結(jié)構中包含2個α螺旋，15個β折疊（見圖3a）。

圖2 基于Eh V99B1－Sp和GeneBank中其他9種物種Sp氨基酸序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic inference tree based on the amino acid sequences of Sp from different organisms in GenBank

以物種blackrat（PDB登錄號：1ANE）為模板預測Eh V99B1－Sp的三級結(jié)構，兩個物種的絲氨酸蛋白酶的三級結(jié)構都具有一個疏水口袋（活性部位），AICNGDSGGPLF位于該酶催化活性部位的核心位置，其周圍的α螺旋和β折疊區(qū)域展開形成口袋結(jié)構，His87、Asp187和Ser245組成催化三聯(lián)體結(jié)構（見圖3b）。

3.3 p ET32a－Eh V99B1－Sp的活性檢測

在1%脫脂牛奶平板上，對照BL21－p ET32a不形成降解牛奶的水解圈，而 BL21－p ET32a－Eh V99B1－Sp則降解牛奶形成明顯的水解圈，表明其分泌的蛋白酶具有生物學活性（見圖4）。

3.4 p ET32a－S p在E.coli BL21中的表達及純化的電泳檢測

p ET32a表達載體融合了Trx和His標簽蛋白，標簽的大小為20.5 k Da，目的基因表達的蛋白在39.5 k Da左右，融合蛋白的預計分子量約為60 k Da。通過優(yōu)化誘導表達條件，最終用終濃度為0.5 mmol／L的IPTG在18℃誘導10 h獲得了高效表達，可溶性蛋白占總蛋白的23.4%。經(jīng)Ni－NATagarose親和層析獲得純化的重組蛋白（見圖5a）。

3.5 Western－bloting檢測目的蛋白的特異性

取少量純化蛋白和未誘導菌體蛋白（陰性對照）進行SDS－PAGE，電轉(zhuǎn)移至NC膜。用鯉魚肌肉MBSP作為一抗，HRP標記的兔抗鼠Ig G作為二抗，DAB顯色后在預期大小（60 k Da）處可見清晰染色條帶，分子量為60 k Da（見圖5b），表明重組表達蛋白為絲氨酸蛋白酶。

4 討論

絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有機體中發(fā)揮著重要的生理作用，具有廣泛的研究和應用價值［9］。絲氨酸蛋白酶超家族成員具有多種多樣的生理功能，在機體很多致病過程以及細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導等方面起著重要作用。在長期的進化過程中，絲氨酸蛋白酶氨基酸序列產(chǎn)生了很大的差異，絲氨酸蛋白酶超家族成員的某些蛋白質(zhì)序列的相似度甚至低于20%，但該蛋白質(zhì)的活性結(jié)構域卻極其保守，都具有一個類似于口袋狀的核心催化結(jié)構域 Asp－His－Ser［17］。由于絲氨酸蛋白酶在結(jié)構上的微小變化，導致其在功能上的進化。本實驗從Eh V99B1中克隆獲得了Eh V99B1－Sp基因，表達產(chǎn)物經(jīng)Western－bloting檢測，顯示純化獲得的蛋白為絲氨酸蛋白酶，分子量大小與預期的相符合，生物信息學分析與其他物種的Sp蛋白的同源性很低，只有28%～32%，但其蛋白結(jié)構域中也保留了LTAGHC和AICNGDSGGPLF兩個非常保守的水解酶催化活性位點的氨基酸基序。說明球石藻病毒的Sp在結(jié)構與功能上與其他物種之間存在著一定的差異，可能是絲氨酸蛋白酶家族的一個新成員。

圖3 Eh V99B1－Sp蛋白結(jié)構預測圖Fig.3 Predictions of the structures of Eh V99B1－Sp.

圖4 1%脫脂牛奶平板檢測重組菌BL21－p ET32a－Eh V99B1－Sp的蛋白酶酶活Fig.4 Analysis of Eh V99B1－Sp protease activity on the 1%degreased milk plate

基因橫向轉(zhuǎn)移是指遺傳物質(zhì)從一個生物體轉(zhuǎn)移到另一個不同的生物體中，或者單個細胞內(nèi)部的細胞器之間進行遺傳物質(zhì)的交流，生物個體之間進行遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移沒有親緣關系以及方向的界限［18］?；驒M向轉(zhuǎn)移現(xiàn)象廣泛存在于噬菌體、真核病毒以及一些普通的轉(zhuǎn)導粒子。大量的研究表明病毒能夠利用基因橫向轉(zhuǎn)移影響宿主的新陳代謝、免疫能力和分布情況，最為典型的例子要屬藍藻病毒，其基因組攜帶有來自宿主的光合作用基因（如psbA和psbD），這些基因在強光下可誘導表達，被認為是在藍藻病毒裂解周期中用于延長光合作用效應來維持該病毒質(zhì)子泵系統(tǒng)的運轉(zhuǎn)［19］，類似的現(xiàn)象也在痘病毒和Mi mi病毒中被發(fā)現(xiàn)［20—21］。另外，研究發(fā)現(xiàn)海洋紅細菌Rhodobacter和玫瑰桿菌Rosebacterlitor alis的普遍轉(zhuǎn)導子可以作為載體將宿主基因包裹在其病毒顆粒內(nèi)，通過洋流橫向轉(zhuǎn)移給其他生態(tài)系統(tǒng)的細菌，促使同一類群細菌基因組協(xié)同進化［22—23］。因此，基因橫向轉(zhuǎn)移現(xiàn)象其實質(zhì)是宿主與病毒相互作用的結(jié)果。在Eh V基因組中存在7個預測編碼SBP關鍵催化酶的基因，這些基因不存在于其他已知的病毒中，但是存在于宿主基因組中，證實SBP基因在病毒和真核生物之間進行了橫向轉(zhuǎn)移［24］。本研究獲得的Eh V99B1－Sp基因與宿主的Sp基因同源性只有34.2%，因此，我們推測該病毒的Sp基因并非從宿主細胞直接通過基因橫向轉(zhuǎn)移獲得，而可能是在長期進化過程中由病毒自身攜帶或者從其他生物逐步轉(zhuǎn)移而來。

圖5 p ET32a－Eh V99B1－Sp重組蛋白表達的SDS－PAGE分析及 Western－blot分析Fig.5 Analysis of p ET32a－Eh V99B1－Sp fusion protein expressed in E.coli by SDS－PAGE and Western－blot

大量的研究證實絲氨酸蛋白酶具有促進細胞凋亡的作用［12—14］。Eh V感染可以誘導宿主細胞PCD并伴隨著Metacaspase的高活性表達，而且PCD被認為可能是該病毒調(diào)控其宿主死亡的重要方式［25］。絲氨酸蛋白酶不僅可以作為內(nèi)切酶對肽鏈中部起催化作用，還具有切除靶蛋白鏈末端氨基酸殘基的功能［10］。Eh V99B1的全基因組已經(jīng)測序［26］，我們對Eh V99B1中另外3種假定的蛋白酶（ehv109類似于半胱氨酸蛋白酶，ehv133ATP依賴的絲氨酸蛋白酶水解亞基，ehv349半胱氨酸蛋白酶）進行胰凝乳蛋白酶酶切位點預測，發(fā)現(xiàn)這3種蛋白酶中有兩種蛋白酶被預測存在胰凝乳蛋白酶酶切位點，且分值大于0.5，表明這兩種假定的蛋白酶可能被Eh V99B1－Sp進行特異的切割。同時，生物信息分析顯示Eh V99B1－Sp是一個二次跨膜蛋白，因此，其可能作為信號通路中的一個調(diào)節(jié)因子參與Metacaspase酶原的激活，從而參與宿主細胞PCD進程。另外，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，Eh V99B1－Sp與Ctenocephalidesf elis絲氨酸蛋白酶的同源性較高，而C.f elis絲氨酸蛋白酶可以通過蛋白酶水解切割受體蛋白，使其構象發(fā)生改變，從而介導受體的定位和激活，進而啟動跨膜信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)通路［25］，進一步為我們的觀點提供了證據(jù)。而且有趣的是，Eh V感染宿主過程中伴隨著神經(jīng)酰胺的合成，而蛋白酶酶原的激活與神經(jīng)酰胺介導的凋亡途徑緊密相關［7］。神經(jīng)酰胺作為神經(jīng)鞘脂類物質(zhì)的主要成員之一，是機體調(diào)節(jié)各種細胞活動重要的第二信使，其在胞內(nèi)的合成水平能夠影響多種細胞活動，特別是細胞凋亡和生長抑制活動［27］。因此，絲氨酸蛋白酶作為迄今已知的最大的蛋白酶家族之一，在神經(jīng)酰胺的合成過程中可能發(fā)揮重要的作用。

絲氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白水解酶，人們對其結(jié)構和功能已經(jīng)進行了深入的研究，并有不少種類的絲氨酸蛋白酶已應用于醫(yī)藥等領域。在這些研究成果的基礎上人們可以通過絲氨酸蛋白酶基因的克隆、重組、表達以及蛋白互作等技術有效提高其產(chǎn)量，為絲氨酸蛋白酶的應用提供了新的思路。Eh V99B1－Sp在大腸桿菌中的高表達可能與下面兩個因素有關：第一，低溫條件下誘導能夠降低蛋白的合成速度，促進蛋白質(zhì)的正確折疊。第二，Eh V99B1－Sp獲得可溶性表達可能是由于其N端融合了Trx標簽，幫助表達蛋白形成二硫鍵，從而使蛋白溶解性及活性得到增強。采用革蘭氏陰性大腸桿菌BL21（蛋白酶缺陷型）作為受體菌，證實克隆基因的表達產(chǎn)物具有明顯的蛋白酶活性。我們用胰蛋白酶的特異性底物Boc－Phe－Ser－Arg－MCA 和 Boc－Leu－Lys－Arg－MCA 分 析Eh V99B1－Sp的底物特異性，結(jié)果顯示 Boc－Phe－Ser－Arg－MCA和 Boc－Leu－Lys－Arg－MCA 不能被 該酶分解，表明該酶可能是不具有胰蛋白酶特性的絲氨酸蛋白酶。本研究結(jié)果為進一步探討Eh V99B1－Sp在球石藻病毒與宿主相互作用過程中的調(diào)節(jié)作用以及該病毒Sp的功能與應用奠定了基礎。

［1］Rohwer F，Thurber R V.Vir uses manipulate the marine environ ment［J］.Nature，2009，459（7244）：207－212.

［2］Lindell D，Jaffe J D，Coleman M L，et al.Genome－wide expression dynamics of a marine virus and host reveal features of co－evolution［J］.Nature，2007，449（7158）：83－86.

［3］Bidle K D，Varid A.A chemical ar ms race at sea mediates algal host－virus interactions［J］.Curr Opin Microbiol，2011，14（4）：449－457.

［4］Vardi A，Van Mooy B A S，F(xiàn)redricks H F，et al.Viral glycosphingolipids induce lytic infection and cell deat h in marine phytoplankton［J］.Science，2009，326（5954）：861－865.

［5］Castberg T，Thyr haug R，Larsen A，et al.Isolation and characterization of a virus that infectsEmilianiahuxleyi（Haptophyta）［J］.J Phycol，2002，38（4）：767－774.

［6］Si mpson A A，Nandhagopal N，Van Etten J L，et al.Structural analyses ofPhycodnaviridaeandIridovir dae［J］.Acta Crystallogr，Sect D：Biol Crystallogr，2003，59（12）：2053－2059.

［7］Kegel J U，Blaxterm，Allen M J，et al.Transcriptional host－virus interaction ofEmilianiahuxleyi（Haptophyceae）and Eh V－86 deduced from combined analysis of expressed sequence tags and microarrays［J］.Eur J Phycol，2010，45（1）：1－12.

［8］Wilson W H，Schroeder D C，Allen M J，et al.Complete genome sequence and lytic phase transcription profile of aCoccolithovirus［J］.Science，2005，309（5737）：1090－1092.

［9］汪世華，王文勇，黃益洲，等.絲氨酸蛋白酶的研究進展［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2007，22（4）：453－456.

［10］Suzuki C K，Rep M，Van Dijl J M，et al.ATP－dependent proteases that also chaperone protein biogenesis［J］.Trends Biochem Sci，1997，22（4）：118－123.

［11］Kalisz H M.Microbial proteinases［J］.Adv Biochem Eng／Biotechnol，1988，36：1－65.

［12］Gottesman S，Maurizi M R.Regulation by proteolysis：energy－dependent proteases and their targets［J］.Microbiol Rev，1992，56（4）：592－621.

［13］Nier man W C，Pain A，Anderson M J，et al.Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungusAsper gillusf umigatus［J］.Nature，2005，438（7071）：1151－1156.

［14］崔士超，謝利娟，吳紅芝.絲氨酸蛋白酶與植物器官衰老關聯(lián)的研究進展［J］.安微農(nóng)業(yè)科學，2010，38（15）：7742－7743，7745.

［15］張彥鋒，劉靜雯，張稚蘭，等.海洋球石藻（Emilianiahuxleyi）病毒硫氧還蛋白（TRX）基因的克隆及生物信息學分析［J］.海洋與湖沼，2010，41（2）：293－300.

［16］Sambrook J，Russell D W.分子克隆實驗指南［M］.3版.黃培堂，譯.北京：科學出版社，2002.

［17］季星來，孫之榮.基于結(jié)構的絲氨酸蛋白酶超家族進化分析［J］.電子學報，2001，29（12 A）：1756－1758.

［18］黃娟，楊維青，趙祖國.細菌生物被膜菌群間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移［J］.中國抗生素雜志，2013，38（2）：98－101.

［19］Lopez J F，Shi Y，Tyson G W，et al.Microbial community gene expression in ocean surface waters［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（10）：3805－3810.

［20］La Scola B，Desnues C，Pagnier I，et al.The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus［J］.Nature，2008，455（7209）：100－104.

［21］González J M，Esteban M.A poxvirus Bcl－2－like gene family involved in regulation of host immune response：sequence similarity and evolutionary history［J］.Virol J，2010，7：59－70.

［22］Solioz M，Yen H C，Marris B.Release and uptake of gene transfer agent byRhodopseudomonascapsulata［J］.J Bacteriol，1975，123（2）：651－657.

［23］Biers E J，Wang K，Pennington C，et al.Occurrence and expression of gene transfer agent genes in marine bacterioplankton［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74（10）：2933－2939.

［24］Monier A，Pagarete A，Vargas C，et al.Horizontal gene transfer of an entire metabolic pathway bet ween a eukaryotic alga and its DNA virus［J］.Genome Res，2009，19（8）：1441－1449.

［25］Bidle K D，Haramaty L，Ramos J B，et al.Viral activation and recruit ment of metacaspases in the unicellularcoccolithophore，Emilianiahuxleyi［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（14）：6049－6054.

［26］Pagarete A，Lanzen A，Puntervoll P，et al.Genomic sequence and analysis of Eh V－99B1，a newCoccolithovir usfrom the Nor wegain Fjords［J］.Intervirology，2013，56（1）：60－66.

［27］Gaines P J，Sampson cm，Rushlow K E，et al.Cloning of a family of serine protease genes from the cat fleaCtenocephalidesf elis［J］.Insect Mol Biol，1999，8（1）：11－22.