一例棘腹蛙“白內障”的病原分離鑒定

廖冰潔+樊汶樵+周莉+張毅+陳弟詩+孫志芳+吳寶紅

摘要：在患“白內障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分離到一株圓形或橢圓形、葡萄狀堆積的革蘭氏陽性菌，經培養(yǎng)特性觀察和致病性實驗，確定候選菌株CQWU201401為“白內障”的病原；通過針對該菌株的生理生化特性鑒定和16S rDNA測序鑒定結果判定該候選菌株為金黃色葡萄球菌。采用藥敏紙片法對該菌株進行藥敏試驗，在10種藥物中的僅對四環(huán)素有耐藥現(xiàn)象；針對該病原菌的分離鑒定和藥敏試驗為臨床上防治該病提供了參考。

關鍵詞：棘腹蛙；“白內障”；分離鑒定

中圖分類號：S947.2 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0008-03

棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我國特有的珍稀兩棲動物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肅等省[1]。棘腹蛙個體大，肉質鮮美，營養(yǎng)價值高，是名貴的營養(yǎng)滋補食品[2，3]。由于人為濫捕、水體污染、生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生棘腹蛙資源日趨匱乏，種群規(guī)模不斷縮小，已被《中國瀕危動物紅皮書》列為易危物種[4]。近段時期，重慶地區(qū)部分棘腹蛙養(yǎng)殖場流行了一種致棘腹蛙眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜，食欲廢絕，甚至導致患蛙死亡的疾病，給生產上帶來了極大的損失。為解決這一問題，本研究擬分離鑒定該病的病原，并針對性的進行抗生素篩選為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取重慶地區(qū)某養(yǎng)殖場數(shù)只具“白內障”典型癥狀的棘腹蛙作為被檢病料。患病棘腹蛙體重100～120g，體長40～50cm，剖檢后可見眼球外附著一層白色薄膜，眼睛鞏膜部有少量出血點，舌頭表層和口腔內部有散在出血點，食道、胃和腸道出血。

健康棘腹蛙80只，購自重慶市某棘腹蛙養(yǎng)殖場，規(guī)格為每只100 g左右。

酵母提取物、胰蛋白胨等試劑購自OXOID公司；水解酪蛋白（M-H）瓊脂/肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；兔血在無菌條件下采自健康家兔；細菌微量生化管（批號：140123）和藥敏試紙（批號：140227）購于杭州天和微生物試劑有限公司；DNA分子量標準、2×Taq PCR Master Mix等購自北京天根生化科技有限公司；其他常規(guī)試劑由實驗室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 無菌蒸餾水沖洗病蛙體表后，在超凈操作臺中接種病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分內臟器官等于LB固體和液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h；同時做厭氧培養(yǎng)，觀察細菌生長情況。對分離到的細菌進行純化培養(yǎng)，并用5%兔血平板鑒定溶血性；挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢，純化后的候選菌株置-20 ℃保存。

1.2.2 致病性實驗 用平板菌落計數(shù)法調整菌懸液濃度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供試棘腹蛙分為8組，每組10只，暫養(yǎng)一周無任何病變后方可用于實驗；接種組以0.2 mL/只的劑量分別以點眼和腹腔接種的方式接種上述7種濃度的菌懸液；對照組接種0.2 mL/只的無菌生理鹽水。試驗期間外界條件與暫養(yǎng)時相同，隨時觀察棘腹蛙癥狀。出現(xiàn)棘腹蛙死亡即時撈出并剖檢，以不再發(fā)生死亡時為結束時間。從死亡棘腹蛙眼部和內臟再次分離細菌并進行鑒定。計算出出該候選菌株感染棘腹蛙的半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.3 生理生化特性鑒定 取上述純化后的候選菌，接種于細菌微量生化反應管，按照常規(guī)進行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷、肌醇等項目的生理生化特性測定，實驗結果主要參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行判定。

1.2.4 16S rDNA鑒定 采用擴增細菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分別為：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

陽性PCR產物測定結果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對。利用Mega軟件對與該序列類似度較高的序列進行比對并構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 藥敏試驗 挑取純化后的候選菌株單個菌落于M-H肉湯中，28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥氏濃度后用棉拭子蘸取菌液均勻涂布培養(yǎng)基表面，然后用鑷子將紙片貼在瓊脂平板表面。每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm。28 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后測量抑菌圈大小并參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗判斷標準來判定結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果

在剖檢的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分離到一株優(yōu)勢菌，命名為CQWU201401。該候選菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出現(xiàn)微弱溶血環(huán)。革蘭氏染色后在光學顯微鏡下可觀察到圓形或橢圓形、葡萄狀堆積排列的革蘭氏陽性菌。

2.2 致病性實驗結果

候選菌株接種棘腹蛙3 d后減少或停止進食，7 d后陸續(xù)有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖檢可見眼部出現(xiàn)化膿癥狀，口腔和食道有輕微出血，胃部嚴重出血，與自然感染結果一致；從發(fā)病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分離出與候選菌株生理生化特性一致的優(yōu)勢菌。候選菌株的LD50值為2.5×107 CFU/只。對照組棘腹蛙無任何異常（表1）。

摘要：在患“白內障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分離到一株圓形或橢圓形、葡萄狀堆積的革蘭氏陽性菌，經培養(yǎng)特性觀察和致病性實驗，確定候選菌株CQWU201401為“白內障”的病原；通過針對該菌株的生理生化特性鑒定和16S rDNA測序鑒定結果判定該候選菌株為金黃色葡萄球菌。采用藥敏紙片法對該菌株進行藥敏試驗，在10種藥物中的僅對四環(huán)素有耐藥現(xiàn)象；針對該病原菌的分離鑒定和藥敏試驗為臨床上防治該病提供了參考。

關鍵詞：棘腹蛙；“白內障”；分離鑒定

中圖分類號：S947.2 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0008-03

棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我國特有的珍稀兩棲動物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肅等省[1]。棘腹蛙個體大，肉質鮮美，營養(yǎng)價值高，是名貴的營養(yǎng)滋補食品[2，3]。由于人為濫捕、水體污染、生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生棘腹蛙資源日趨匱乏，種群規(guī)模不斷縮小，已被《中國瀕危動物紅皮書》列為易危物種[4]。近段時期，重慶地區(qū)部分棘腹蛙養(yǎng)殖場流行了一種致棘腹蛙眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜，食欲廢絕，甚至導致患蛙死亡的疾病，給生產上帶來了極大的損失。為解決這一問題，本研究擬分離鑒定該病的病原，并針對性的進行抗生素篩選為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取重慶地區(qū)某養(yǎng)殖場數(shù)只具“白內障”典型癥狀的棘腹蛙作為被檢病料?；疾〖雇荏w重100～120g，體長40～50cm，剖檢后可見眼球外附著一層白色薄膜，眼睛鞏膜部有少量出血點，舌頭表層和口腔內部有散在出血點，食道、胃和腸道出血。

健康棘腹蛙80只，購自重慶市某棘腹蛙養(yǎng)殖場，規(guī)格為每只100 g左右。

酵母提取物、胰蛋白胨等試劑購自OXOID公司；水解酪蛋白（M-H）瓊脂/肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；兔血在無菌條件下采自健康家兔；細菌微量生化管（批號：140123）和藥敏試紙（批號：140227）購于杭州天和微生物試劑有限公司；DNA分子量標準、2×Taq PCR Master Mix等購自北京天根生化科技有限公司；其他常規(guī)試劑由實驗室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 無菌蒸餾水沖洗病蛙體表后，在超凈操作臺中接種病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分內臟器官等于LB固體和液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h；同時做厭氧培養(yǎng)，觀察細菌生長情況。對分離到的細菌進行純化培養(yǎng)，并用5%兔血平板鑒定溶血性；挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢，純化后的候選菌株置-20 ℃保存。

1.2.2 致病性實驗 用平板菌落計數(shù)法調整菌懸液濃度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供試棘腹蛙分為8組，每組10只，暫養(yǎng)一周無任何病變后方可用于實驗；接種組以0.2 mL/只的劑量分別以點眼和腹腔接種的方式接種上述7種濃度的菌懸液；對照組接種0.2 mL/只的無菌生理鹽水。試驗期間外界條件與暫養(yǎng)時相同，隨時觀察棘腹蛙癥狀。出現(xiàn)棘腹蛙死亡即時撈出并剖檢，以不再發(fā)生死亡時為結束時間。從死亡棘腹蛙眼部和內臟再次分離細菌并進行鑒定。計算出出該候選菌株感染棘腹蛙的半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.3 生理生化特性鑒定 取上述純化后的候選菌，接種于細菌微量生化反應管，按照常規(guī)進行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷、肌醇等項目的生理生化特性測定，實驗結果主要參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行判定。

1.2.4 16S rDNA鑒定 采用擴增細菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分別為：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

陽性PCR產物測定結果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對。利用Mega軟件對與該序列類似度較高的序列進行比對并構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 藥敏試驗 挑取純化后的候選菌株單個菌落于M-H肉湯中，28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥氏濃度后用棉拭子蘸取菌液均勻涂布培養(yǎng)基表面，然后用鑷子將紙片貼在瓊脂平板表面。每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm。28 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后測量抑菌圈大小并參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗判斷標準來判定結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果

在剖檢的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分離到一株優(yōu)勢菌，命名為CQWU201401。該候選菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出現(xiàn)微弱溶血環(huán)。革蘭氏染色后在光學顯微鏡下可觀察到圓形或橢圓形、葡萄狀堆積排列的革蘭氏陽性菌。

2.2 致病性實驗結果

候選菌株接種棘腹蛙3 d后減少或停止進食，7 d后陸續(xù)有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖檢可見眼部出現(xiàn)化膿癥狀，口腔和食道有輕微出血，胃部嚴重出血，與自然感染結果一致；從發(fā)病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分離出與候選菌株生理生化特性一致的優(yōu)勢菌。候選菌株的LD50值為2.5×107 CFU/只。對照組棘腹蛙無任何異常（表1）。

摘要：在患“白內障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分離到一株圓形或橢圓形、葡萄狀堆積的革蘭氏陽性菌，經培養(yǎng)特性觀察和致病性實驗，確定候選菌株CQWU201401為“白內障”的病原；通過針對該菌株的生理生化特性鑒定和16S rDNA測序鑒定結果判定該候選菌株為金黃色葡萄球菌。采用藥敏紙片法對該菌株進行藥敏試驗，在10種藥物中的僅對四環(huán)素有耐藥現(xiàn)象；針對該病原菌的分離鑒定和藥敏試驗為臨床上防治該病提供了參考。

關鍵詞：棘腹蛙；“白內障”；分離鑒定

中圖分類號：S947.2 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0008-03

棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我國特有的珍稀兩棲動物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肅等省[1]。棘腹蛙個體大，肉質鮮美，營養(yǎng)價值高，是名貴的營養(yǎng)滋補食品[2，3]。由于人為濫捕、水體污染、生態(tài)環(huán)境破壞等因素，野生棘腹蛙資源日趨匱乏，種群規(guī)模不斷縮小，已被《中國瀕危動物紅皮書》列為易危物種[4]。近段時期，重慶地區(qū)部分棘腹蛙養(yǎng)殖場流行了一種致棘腹蛙眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜，食欲廢絕，甚至導致患蛙死亡的疾病，給生產上帶來了極大的損失。為解決這一問題，本研究擬分離鑒定該病的病原，并針對性的進行抗生素篩選為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取重慶地區(qū)某養(yǎng)殖場數(shù)只具“白內障”典型癥狀的棘腹蛙作為被檢病料?；疾〖雇荏w重100～120g，體長40～50cm，剖檢后可見眼球外附著一層白色薄膜，眼睛鞏膜部有少量出血點，舌頭表層和口腔內部有散在出血點，食道、胃和腸道出血。

健康棘腹蛙80只，購自重慶市某棘腹蛙養(yǎng)殖場，規(guī)格為每只100 g左右。

酵母提取物、胰蛋白胨等試劑購自OXOID公司；水解酪蛋白（M-H）瓊脂/肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；兔血在無菌條件下采自健康家兔；細菌微量生化管（批號：140123）和藥敏試紙（批號：140227）購于杭州天和微生物試劑有限公司；DNA分子量標準、2×Taq PCR Master Mix等購自北京天根生化科技有限公司；其他常規(guī)試劑由實驗室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 無菌蒸餾水沖洗病蛙體表后，在超凈操作臺中接種病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分內臟器官等于LB固體和液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h；同時做厭氧培養(yǎng)，觀察細菌生長情況。對分離到的細菌進行純化培養(yǎng)，并用5%兔血平板鑒定溶血性；挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢，純化后的候選菌株置-20 ℃保存。

1.2.2 致病性實驗 用平板菌落計數(shù)法調整菌懸液濃度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供試棘腹蛙分為8組，每組10只，暫養(yǎng)一周無任何病變后方可用于實驗；接種組以0.2 mL/只的劑量分別以點眼和腹腔接種的方式接種上述7種濃度的菌懸液；對照組接種0.2 mL/只的無菌生理鹽水。試驗期間外界條件與暫養(yǎng)時相同，隨時觀察棘腹蛙癥狀。出現(xiàn)棘腹蛙死亡即時撈出并剖檢，以不再發(fā)生死亡時為結束時間。從死亡棘腹蛙眼部和內臟再次分離細菌并進行鑒定。計算出出該候選菌株感染棘腹蛙的半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.3 生理生化特性鑒定 取上述純化后的候選菌，接種于細菌微量生化反應管，按照常規(guī)進行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷、肌醇等項目的生理生化特性測定，實驗結果主要參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行判定。

1.2.4 16S rDNA鑒定 采用擴增細菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分別為：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

陽性PCR產物測定結果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對。利用Mega軟件對與該序列類似度較高的序列進行比對并構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 藥敏試驗 挑取純化后的候選菌株單個菌落于M-H肉湯中，28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥氏濃度后用棉拭子蘸取菌液均勻涂布培養(yǎng)基表面，然后用鑷子將紙片貼在瓊脂平板表面。每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm。28 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后測量抑菌圈大小并參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗判斷標準來判定結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果

在剖檢的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分離到一株優(yōu)勢菌，命名為CQWU201401。該候選菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出現(xiàn)微弱溶血環(huán)。革蘭氏染色后在光學顯微鏡下可觀察到圓形或橢圓形、葡萄狀堆積排列的革蘭氏陽性菌。

2.2 致病性實驗結果

候選菌株接種棘腹蛙3 d后減少或停止進食，7 d后陸續(xù)有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖檢可見眼部出現(xiàn)化膿癥狀，口腔和食道有輕微出血，胃部嚴重出血，與自然感染結果一致；從發(fā)病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分離出與候選菌株生理生化特性一致的優(yōu)勢菌。候選菌株的LD50值為2.5×107 CFU/只。對照組棘腹蛙無任何異常（表1）。