肺炎鏈球菌自溶素LytA小片段免疫活性的研究

鄒 琴，楊 光，羅 紅*，宮曉紅，孫文平

(1.大連醫(yī)科大學(xué)臨床免疫與微生物教研室，遼寧 大連 116044;2.大連市中醫(yī)醫(yī)院，遼寧 大連 116013)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，可以發(fā)生自然轉(zhuǎn)化［1］，根據(jù)其莢膜多糖抗原性的不同分為90多種血清型，其中約20種血清型對(duì)人體有致病性，可引起腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎等多種疾病［2-3］。近年來(lái)肺炎鏈球菌耐藥的普遍性和多重耐藥趨勢(shì)逐漸升高，開(kāi)發(fā)新的藥物和蛋白疫苗進(jìn)行感染的治療和預(yù)防成為研究熱點(diǎn)［4-6］。肺炎鏈球菌自溶素(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA)是肺炎鏈球菌細(xì)胞壁降解酶之一［7］，其編碼基因在不同血清型之間具有高度保守性［8-9］，編碼蛋白可以覆蓋幾乎所有血清型，而且具有免疫活性及溶菌效應(yīng)，有可能成為新的疫苗靶點(diǎn)及抗菌藥物［10-12］。根據(jù)GenBank中收錄的肺炎鏈球菌M66菌株的lytA序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增ATCC49619菌株相應(yīng)基因片段，以常用的BamHⅠ、HindⅢ酶切后出現(xiàn)新的小片段，通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲得該段基因表達(dá)的蛋白，初步研究其免疫活性，為進(jìn)一步應(yīng)用于疫苗及相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC49619)由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA 連接酶、DNA Marker、蛋白Marker、DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa公司)，大腸埃希菌DH5α、表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài)、HRP-羊抗鼠IgG(Novagen公司)，克隆載體PGM-T、質(zhì)粒提取純化試劑盒(天根生化科技有限公司)，表達(dá)載體PET-32α(本實(shí)驗(yàn)室保存)，化學(xué)發(fā)光底物Super-Signal ECL(Pierce公司)，純化蛋白LytA'免疫血清為本實(shí)驗(yàn)室自制(抗體效價(jià)1∶32)。

1.2 方法

1.2.1 肺炎鏈球菌自溶素基因擴(kuò)增、克隆 根據(jù)GenBank中肺炎鏈球菌M66菌株lytA基因全序列(FN549899.1)，設(shè)計(jì)上下游引物:P1為 5'-GGGGGATCCATGGAAATTAATGTGAGT-3'，P2 為5'-GGGAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCCATC-3'，斜體部分為引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，引物由 TaKaRa公司合成。提取肺炎鏈球菌(ATCC49619)基因組DNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段(95℃ 4 min;95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min、30個(gè)循環(huán);72℃ 7 min)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。切膠回收，構(gòu)建克隆質(zhì)粒PGM-T/lytA'，測(cè)序由TaKaRa公司完成。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒用BamHⅠ、HindⅢI雙酶切，將出現(xiàn)的約500 bp小片段切膠回收，與pET-32α(+)載體酶切后的片段16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，于LB/Amp平板上挑取單個(gè)克隆培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并再次測(cè)序，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32α(+)/lytA'。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)，涂布于LB/Amp平板，篩選陽(yáng)性克隆接種于LB/Amp液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A600值為0.6 ～0.8)，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，25℃誘導(dǎo)4 h;4℃離心收集菌體，加入裂解液超聲破碎，4℃離心收集上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用透析袋等電點(diǎn)洗脫法回收純化蛋白LytA'并定量分析，保存于－80℃冰箱。

1.2.4 免疫血清制備 取6只BALB/c小鼠，雌雄各半，18～20 g，5～6周齡(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。LytA'免疫血清制備程序:首次免疫每只小鼠腹股溝皮下注射LytA'0.2 mg;分別于第14及第21天加強(qiáng)免疫，每只皮下注射0.2 mg。末次免疫后第5天摘取小鼠眼球進(jìn)行采血，分離血清，與純化蛋白進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，測(cè)定抗體效價(jià)后于－20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物 Western blot分析 將純化的LytA'蛋白按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)到NC膜上，以上述免疫血清作為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗，ECL顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 肺炎鏈球菌自溶素基因的擴(kuò)增、克隆

lytA全序列擴(kuò)增產(chǎn)物約950 bp處可見(jiàn)特異性條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果(956 bp)相符。重組克隆質(zhì)粒PGM-T/lytA測(cè)序結(jié)果與GenBank中M66菌株的基因序列符合率為98%，不同之處主要位于444～466 bp，肺炎鏈球菌ATCC49619菌株新增了一個(gè)BamHⅠ酶切位點(diǎn)(GGATCC)，PGM-T/lytA經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后出現(xiàn)3條帶(圖2)。

圖1 肺炎鏈球菌lytA的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification of lytA of S.pn

圖2 重組質(zhì)粒PGM-T/lytA酶切圖Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid PGM-T/lytA

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

構(gòu)建的小片段自溶素的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32α(+)/lytA'經(jīng) BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后顯示約500 bp目的片段。序列測(cè)定結(jié)果顯示該片段基因與肺炎鏈球菌ATCC49619菌株的克隆質(zhì)粒PGMT/lytA相應(yīng)部分符合率為100%，未出現(xiàn)變異。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)與純化

小片段自溶素的重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-32α(+)/lytA'經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約20 ku處有明顯的蛋白表達(dá)條帶(圖3)，該蛋白主要以可溶性上清形式存在，用等電點(diǎn)洗脫法純化后電泳顯示為單一蛋白條帶(圖4)。

2.4 免疫血清制備

LytA'免疫小鼠血清抗體效價(jià)為1∶32，所獲得的目的蛋白具有較好的免疫原性。

2.5 Western blot分析

LytA'與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，相對(duì)分子質(zhì)量約20 ku處出現(xiàn)明顯印跡反應(yīng)帶(圖5)，該目的蛋白具有較好的抗體結(jié)合活性。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32α(+)/lytA'的IPTG誘導(dǎo)結(jié)果Fig.3 Analysis of the products expressed by pET-32α(+)/lytA'with IPTG induction

圖4 純化蛋白LytA'的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE profile of purified protein LytA'

3 討論

肺炎鏈球菌自溶素是肺炎鏈球菌的主要毒力因子之一，在不同血清型的肺炎鏈球菌中具有高度保守性，這一特性作為疫苗靶點(diǎn)可以預(yù)防不同血清型引起的感染，而且作為蛋白質(zhì)，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫記憶，克服了多糖疫苗的局限性［13］。通過(guò)基因工程技術(shù)獲取重組蛋白，不但可以大量獲得而且便于分子結(jié)構(gòu)的修飾改良，本研究證明了肺炎鏈球菌自溶素LytA其中的一個(gè)小片段可以通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲得，初步證明具有免疫原性和抗體結(jié)合活性，為進(jìn)一步應(yīng)用于血清學(xué)診斷和疫苗靶點(diǎn)研究奠定基礎(chǔ)。

GenBank中尚未收錄ATCC49619菌株的自溶素序列，本研究參照已公布的肺炎鏈球菌M66菌株自溶素序列(FN549899.1)設(shè)計(jì)引物，成功擴(kuò)增克隆了肺炎鏈球菌ATCC49619菌株的956 bp自溶素全片段，所構(gòu)建的克隆質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果和M66菌株基因序列同源性為98%，證明了lytA基因序列的保守性。堿基變異的區(qū)域主要集中在444～466 bp之間，而且在此區(qū)域內(nèi)堿基的變異恰巧形成了一個(gè)BamHⅠ酶切位點(diǎn)，這就提示如果利用ATCC49619菌株表達(dá)整段的自溶素蛋白，就需要避免用BamHⅠ酶進(jìn)行克隆質(zhì)粒的酶切。本研究中利用BamHⅠ酶切位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建小片段自溶素重組表達(dá)質(zhì)粒，成功表達(dá)出分子量約20 ku的自溶素蛋白片段，相比于全段rLytA(分子量約56 ku)，小分子量蛋白片段用于藥物及疫苗靶點(diǎn)可能更具有優(yōu)勢(shì)，而且和抗體結(jié)合時(shí)有利于減少空間位阻，通過(guò)免疫小鼠及Western blot實(shí)驗(yàn)證明該蛋白具有免疫原性和抗體結(jié)合活性，具有應(yīng)用于疫苗及血清學(xué)診斷的可能性。通常以pET32α(+)載體構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)出來(lái)的是一種融合蛋白，在目的蛋白的N末端融合有分子量約20 ku的硫氧還原蛋白，本實(shí)驗(yàn)中的目的蛋白雖然分子量約為20 ku，但所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過(guò)測(cè)序，證實(shí)為自溶素的片段，并非是硫氧還原蛋白，具有不必切除硫氧還原蛋白，直接應(yīng)用于相關(guān)研究的優(yōu)勢(shì)。

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