嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株smp基因缺失株的構(gòu)建及鑒定

秦江楠，畢春霞，陳秀琴，羅 瑋，張 衛(wèi)，任 瑩，王 斌，閆志勇*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，山東 青島 266071;2.青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266071)

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)屬黃單胞菌科寡養(yǎng)單胞菌屬，是一種專性需氧的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于水、土壤、動(dòng)物體內(nèi)，為條件致病菌。近年來該菌已成為嚴(yán)重的醫(yī)院感染菌，其臨床分離率在非發(fā)酵菌中僅次于銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌［1］。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是多重耐藥菌，不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素天然耐藥，而且對(duì)喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類等也有一定的抗性［2］。此外，研究證實(shí)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌能產(chǎn)生多種具有生物活性的蛋白，如淀粉酶、脂肪酶、透明質(zhì)酸酶、堿性磷酸酶、蛋白酶等，這些分泌的蛋白對(duì)該菌的致病性和耐藥性發(fā)揮了一定作用［3-4］。從海洋生物雙齒圍沙蠶消化道分離得到1株可大量分泌SMP蛋白(protein of S.maltophilia，SMP)的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(D2株，國(guó)家發(fā)明專利號(hào)ZL200710005055)。研究發(fā)現(xiàn)［5］，該蛋白為胞外分泌，在培養(yǎng)液上清中產(chǎn)量大、純度高，且蛋白分泌情況受培養(yǎng)基種類的不同影響較大，即具有可調(diào)控性［5］，這種高產(chǎn)量胞外分泌現(xiàn)象在其他野生菌株中較為少見。目前已證實(shí)SMP具有一定堿性磷酸酶活性，并獲得了其完整的基因序列(smp，GenBank收錄號(hào)GQ413951);此外，還發(fā)現(xiàn)smp基因與其Ⅱ型分泌系統(tǒng)基因(T2SS)緊密串聯(lián)，且前端具有信號(hào)肽序列。為進(jìn)一步了解D2株SMP蛋白的功能及其分泌機(jī)制，本研究利用同源重組的方法構(gòu)建了嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株的smp基因缺失株，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究中使用的菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基與抗生素 蔗糖培養(yǎng)基:胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，瓊脂1.5%，高壓后加入相應(yīng)體積的蔗糖儲(chǔ)存液至終濃度為15%(蔗糖儲(chǔ)存液濃度為40%，110℃高壓15 min);本研究中所用抗生素濃度:氨芐青霉素(Amp)100 μg/mL、氯霉素(Cm)25 μg/mL。

1.1.3 主要試劑和儀器 實(shí)驗(yàn)所用Taq DNA聚合酶、T4連接酶、高保真酶、dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase為TaKaRa公司產(chǎn)品;PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒為QIAGEN生產(chǎn);電泳儀、凝膠成像儀等為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2野生株的藥物敏感性測(cè)試 準(zhǔn)備氨芐青霉素、羧芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素和慶大霉素，稀釋法依次配制含有不同濃度以上抗生素的LB液體培養(yǎng)基(因后續(xù)試驗(yàn)多數(shù)在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行，故以LB培養(yǎng)基代替MH培養(yǎng)基進(jìn)行藥物敏感檢測(cè));從新鮮平板上取D2菌用生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木海謩e接種到培養(yǎng)基中，25℃，搖菌24 h。

1.2.2 smp基因上下游同源臂及cat基因的擴(kuò)增根據(jù)D2株smp基因上下游同源臂各500 bp左右的序列和氯霉素抗性基因cat序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見表2。其中上下游同源臂擴(kuò)增的模板為D2野生株基因組，cat基因的擴(kuò)增模板為 cosmid5。上游同源臂和下游同源臂擴(kuò)增使用TaKa-Ra的 PrimerSTAR?HS DNA Polymerase制品，擴(kuò)增參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min。cat基因使用Pyrobest?DNA Polymerase，擴(kuò)增參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min。試劑盒純化PCR產(chǎn)物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 SOE-PCR連接各片段 將上游同源臂、下游同源臂、cat基因的純化產(chǎn)物按1∶1∶1比例混合，混合DNA片段作為融合PCR反應(yīng)的模板，引物對(duì)為up-1和down-2。反應(yīng)參數(shù)同1.2.2中同源臂的擴(kuò)增，但延伸時(shí)間變?yōu)?.5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、電泳鑒定并估測(cè)濃度。

1.2.4 重組自殺質(zhì)粒 pEX18Tc-Δsmp/cat的構(gòu)建分別將融合片段、自殺質(zhì)粒pEX18Tc用SacⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物各自純化后，按照一定比例用T4 DNA連接酶連接，16℃過夜。重組自殺載體pEX18Tc-Δsmp/cat鈣轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌SM10λpir，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在37℃，200 r/min活化1 h后涂布具有氯霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落提取基因組DNA，以cat-1/cat-2為引物，通過PCR、酶切鑒定并測(cè)序，挑選出含有融合片段并且測(cè)序正確的重組自殺質(zhì)粒。

1.2.5 第1次同源重組 將含有重組自殺質(zhì)粒的大腸埃希菌SM10λpir(SmS，鏈霉素敏感)和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2(CmS，氯霉素敏感)菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基，180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8，各自最適溫度為37和30℃。然后4℃、5000 r/min 離心 5 min，收集菌體，再用 100 μL LB液體培養(yǎng)基重懸兩菌。將菌液點(diǎn)樣于1cm2大小的0.45 μm微孔濾膜，濾膜貼于LB固體培養(yǎng)基，30℃ 過夜接合。用1 mL LB液體培養(yǎng)基洗滌濾膜，吸取適量洗下的菌液涂布在含有雙抗(Sm和Cm)的 LB平板上，30℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單個(gè)菌落。

1.2.6 第2次同源重組及D2 smp缺失株的鑒定挑取雙抗平板上的單克隆菌落，接種普通LB平板傳1代復(fù)蘇后，再分別接種到含15%蔗糖的LB平板上，23℃培養(yǎng)2 d長(zhǎng)出單克隆菌落，即為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2 smp缺失株。挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物分別為cat-1/cat-2和smp-F/smp-R(缺失基因smp內(nèi)部引物)，以野生株D2為對(duì)照。

1.2.7 D2缺失株與野生株的蛋白表達(dá)觀察 將D2野生株和Δsmp缺失株D2分別接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h，菌液離心后取適量上清進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察兩菌SMP蛋白的分泌情況。

1.2.8 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2 smp缺失株生長(zhǎng)情況的觀察 將D2野生株與Δsmp突變株分別從新鮮培養(yǎng)基接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min過夜培養(yǎng);次日將上述菌液按1∶100比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)至OD600為0.8。此時(shí)將兩菌液稀釋入5 mL的LB培養(yǎng)基中，調(diào)至相同的OD600吸光值，每隔1 h測(cè)1次吸光值，重復(fù)測(cè)量3次，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.9 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2 smp缺失株生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)的檢測(cè) 采用BD PHOENIX100全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌野生株和突變株進(jìn)行生化及藥物敏感性測(cè)定。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

表2 試驗(yàn)引物Table 2 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 D2野生株的藥物敏感性測(cè)試結(jié)果

稀釋法測(cè)試D2株的藥物敏感性，結(jié)果顯示嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株對(duì)氨芐青霉素、羧芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素等多種抗生素均耐藥;在含有一定濃度的氯霉素和四環(huán)素培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，其中氯霉素的最低抑菌濃度為25 μg/mL，四環(huán)素的最低抑菌濃度為12.5 μg/mL，故選擇這2種抗生素作為后續(xù)同源重組的篩選標(biāo)記。

2.2 smp基因上下游同源臂片段、cat基因片段及融合PCR片段的鑒定

以引物對(duì)up-1/up-2擴(kuò)增smp基因上游同源臂，大小為547 bp;以引物對(duì)down-1/down-2擴(kuò)增smp基因的下游同源臂，大小為541 bp;以引物對(duì)cat-1/cat-2擴(kuò)增cat基因，大小為847 bp;以引物對(duì)up-1/down-2擴(kuò)增搭橋產(chǎn)物，大小為1855 bp。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖1，產(chǎn)物片段大小相符。

圖1 上下游同源臂及融合片段的PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of the up/down stream and SOE-PCR production

2.3 重組自殺質(zhì)粒pEX18Tc-Δsmp/cat的鑒定

將載體pEX18Tc和搭橋片段(帶有cat基因)各自雙酶切后進(jìn)行連接，TSS法轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌SM10λpir，在含有氯霉素的LB平板上培養(yǎng)，篩選出陽性克隆。利用引物對(duì)cat-1/cat-2進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆，大小為840 bp左右(圖2A);酶切鑒定(圖2B)及測(cè)序正確。

圖2 重組自殺質(zhì)粒的鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid

2.4 嗜麥芽假單胞菌D2Δsmp缺失株的篩選和鑒定

大腸埃希菌SM10λpir和嗜麥芽假單胞菌D2在微孔濾膜上接合成功，在氯霉素和鏈霉素的雙抗平板上長(zhǎng)出單個(gè)菌落。接合子通過蔗糖篩選實(shí)驗(yàn)，篩選出突變株D2。用插入的cat基因引物對(duì)cat-1/cat-2和缺失的smp基因引物(smp-F/smp-R)進(jìn)行PCR鑒定，野生株DNA為對(duì)照。結(jié)果顯示野生株擴(kuò)增出smp基因片段(725 bp)，未擴(kuò)出cat基因;而突變株擴(kuò)增出cat基因片段(847 bp)，未擴(kuò)出smp基因，證實(shí)同源重組成功(圖3)。

2.5 野生株與突變株蛋白表達(dá)比較

野生D2株和D2缺失株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE，野生D2株可見42 ku的SMP蛋白條帶，缺失株則無該蛋白條帶(圖4)。

圖3 突變株的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of mutant

圖4 兩菌分泌蛋白SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of SMP expression

2.6 D2缺失株的生長(zhǎng)曲線

D2野生株和缺失株在LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線基本一致(圖5)。

圖5 D2野生株和缺失株在LB中的生長(zhǎng)曲線Fig.5 The grouth curve of wild-type and Δsmp strains

2.7 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2Δsmp缺失株生化試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)

經(jīng)鑒定，2株菌各生化結(jié)果相同，系統(tǒng)均鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，藥敏結(jié)果顯示，野生株對(duì)氯霉素敏感，突變株對(duì)氯霉素耐藥，除氯霉素之外的其他抗生素敏感性均相同。

3 討論

近年來，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌因具有多重耐藥性，致使該菌的醫(yī)院感染率逐年上升，在非發(fā)酵型革蘭陰性菌中位居第3位［6］。另外，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌能分泌多種生物活性物質(zhì)，因而具有較高的研發(fā)應(yīng)用價(jià)值。本研究中獲得的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株在某些特定培養(yǎng)基中(如富含蛋白胨的牛肉膏培養(yǎng)基等)能夠胞外大量分泌SMP蛋白，其編碼基因(smp)與Ⅱ型分泌系統(tǒng)基因簇緊密串聯(lián)，且前24個(gè)氨基酸序列為信號(hào)肽［7］，其分泌機(jī)制對(duì)于開發(fā)新的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)具有一定的研究?jī)r(jià)值。本研究構(gòu)建了該菌的smp基因缺失株，以期為進(jìn)一步研究SMP蛋白的功能及其分泌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

研究基因功能的一個(gè)重要方法就是構(gòu)建目的基因的突變株，將目的基因敲除使之失活，然后通過突變株的表型變化來推測(cè)基因的相關(guān)功能。基因敲除比較常用的方法是通過同源重組將外源基因與宿主染色體的同源序列進(jìn)行相應(yīng)的交換，而傳統(tǒng)的同源重組體系為大腸埃希菌內(nèi)部的RecA重組系統(tǒng)［8］和近年來研究較多的噬菌體Red重組系統(tǒng)［9-10］。本研究采用的是經(jīng)典的RecA重組系統(tǒng)，對(duì)smp基因進(jìn)行敲除，并以氯霉素抗性基因cat替換。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌基因敲除方面的研究較罕見，之前我們?cè)鴩L試了多種自殺質(zhì)粒，如 pKD46、pWM91、pSD132等，轉(zhuǎn)化入供體菌大腸埃希菌DH5αλpir，但與受體菌D2的接合均未成功。臺(tái)灣的Hu RM等［11-12］首次報(bào)道采用pEX18Tc自殺質(zhì)粒對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)基因進(jìn)行敲除并獲得成功，根據(jù)其經(jīng)驗(yàn)選用該質(zhì)粒，供體菌則選用大腸埃希菌SM10λpir，最終獲得成功。

某種細(xì)菌如大量合成某種蛋白，則該蛋白往往能在該菌的生命過程中發(fā)揮重要作用，在smp基因敲除后該菌是否還能存活，如缺失株不能存活則會(huì)嚴(yán)重影響進(jìn)一步研究的策略。然而，通過比較D2野生株和缺失株的生長(zhǎng)曲線、生理生化等特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，smp基因的缺失對(duì)該菌生長(zhǎng)并無明顯的影響，證實(shí)SMP蛋白并非D2株生命活動(dòng)所必需。此外，本研究敲除的是D2的包含信號(hào)肽在內(nèi)的完整的smp基因，因而得到突變株并未顯著表達(dá)出置換smp基因的cat基因。

綜上所述，本研究為今后深入了解嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP蛋白胞外分泌機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，如果信號(hào)肽作用如所設(shè)想的一樣，那么嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株經(jīng)基因改造后即有望成為一種新的原核表達(dá)載體。

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