昆蟲(chóng)腸道菌對(duì)反枝莧的除草活性篩選及菌株JC-03的初步鑒定

方雅紅，陳 潔，施曉莉，蔡穎宇，吳忠云，張應(yīng)烙

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

反枝莧(Amaranthus retroflexus L.)是我國(guó)的惡性入侵雜草，嚴(yán)重危害旱田農(nóng)作物［1］。目前，化學(xué)防治是治理反枝莧危害的主要措施，但化學(xué)除草劑的長(zhǎng)期使用帶來(lái)了諸如環(huán)境污染日趨嚴(yán)重和耐藥雜草種群的上升等問(wèn)題［2-3］，從而加大了防除難度。因此，研究開(kāi)發(fā)新型除草劑迫在眉睫。篩選和利用微生物代謝產(chǎn)物防治雜草具有許多潛在優(yōu)勢(shì)，是新型除草劑的重要研發(fā)方向［4-6］。已有研究表明昆蟲(chóng)腸道菌能分泌一些消化酶幫助昆蟲(chóng)消化食物［7-8］，也有可能合成植物毒素，這類(lèi)毒素能殺死植物以利于昆蟲(chóng)消化吃進(jìn)去的植物［9］。因此，昆蟲(chóng) (特別是植食性昆蟲(chóng))腸道菌可能是新穎除草劑的重要來(lái)源。在較系統(tǒng)研究棉蝗和負(fù)蝗腸道菌除草活性的基礎(chǔ)上［9-11］，活性篩選表明1株大黑金龜子腸道菌JC-03對(duì)反枝莧具有較好的除草活性。本文報(bào)道該活性菌株并初步確定其分類(lèi)地位，旨在為開(kāi)發(fā)新型微生物源除草劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試雜草及常見(jiàn)作物 反枝莧種子采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)周邊，旱田常見(jiàn)作物如油菜、大豆、西紅柿、辣椒種子購(gòu)于金華市種子市場(chǎng)。

1.1.2 供試?yán)ハx(chóng) 甲蟲(chóng)、負(fù)蝗、天牛、棉蝗和蚱蜢等捕自浙江師范大學(xué)周邊。

1.1.3 MEA培養(yǎng)基 生麥芽20 g，加水煮沸30 min，以紗布濾去殘?jiān)瑸V液加水補(bǔ)足至1000 mL，加入15～20 g瓊脂加熱熔化，再加蔗糖20 g及蛋白胨1 g溶解，分裝，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min備用。不加瓊脂者為相應(yīng)液體培養(yǎng)基(ME)。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離和純化 參考文獻(xiàn)［11］的方法，分離前讓昆蟲(chóng)饑餓24 h，在無(wú)菌條件下用75%酒精表面消毒，無(wú)菌水漂洗3次后解剖，取出昆蟲(chóng)腸道，加少量無(wú)菌水在無(wú)菌研缽中研磨，用無(wú)菌水對(duì)研磨液梯度稀釋成 10-1、10-2、10-3，分別取各梯度稀釋液0.2 mL涂布于MEA培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌體長(zhǎng)出后，挑取所需菌落邊緣菌絲純化培養(yǎng)，最終得到14株昆蟲(chóng)腸道菌。

1.2.2 菌種的發(fā)酵及發(fā)酵產(chǎn)物的提取 采用液體發(fā)酵的方法，挑取已純化的帶有培養(yǎng)基的菌絲體接種到裝有約400 mL ME液體培養(yǎng)基的1000 mL錐形瓶中，于搖床上220 r/min 28℃振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)約7 d后，獲得發(fā)酵液。所得發(fā)酵液在室溫下經(jīng)紗布過(guò)濾后得濾液，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取多次，直至上層乙酸乙酯層無(wú)色為止。將得到的乙酸乙酯層溶液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮至干即得粗浸膏［12］。

1.2.3 JC-03不同極性發(fā)酵產(chǎn)物的提取 參照1.2.2，對(duì)JC-03進(jìn)行液體發(fā)酵并得到發(fā)酵濾液，濾液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮分別得石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。

1.2.4 昆蟲(chóng)腸道菌粗提物的除草活性測(cè)試 參照文獻(xiàn)［13］，用培養(yǎng)皿生物分析法(Petri dish bioassay)測(cè)定發(fā)酵液粗提物對(duì)反枝莧的除草活性，具體操作如下:用0.2%次氯酸鈉浸泡反枝莧種子15 min后用清水洗滌3次，將處理過(guò)的反枝莧種子置于室溫下浸泡1 d催芽露白后備用。用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)取發(fā)酵液粗提物，再用丙酮稀釋成濃度為100 μg/mL的藥液。在鋪有濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中加入待測(cè)藥液5.00 mL，待溶劑揮發(fā)后即得藥膜，再加入5.00 mL蒸餾水后，挑選20粒大小、色澤、成熟度一致的反枝莧露白種子均勻置于培養(yǎng)皿中，蓋好皿蓋，將培養(yǎng)皿放入28℃智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另設(shè)丙酮和相同濃度的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)分別作為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。處理1～2 d后測(cè)定反枝莧幼苗的莖和根長(zhǎng)，求出抑制率。抑制率的計(jì)算公式:抑制率(%)=［(空白對(duì)照組幼苗莖或根的長(zhǎng)度-實(shí)驗(yàn)組幼苗莖或根的長(zhǎng)度)/(空白對(duì)照組幼苗莖或根的長(zhǎng)度)］×100%。

1.2.5 JC-03粗提物對(duì)作物的安全性測(cè)定 參照文獻(xiàn)［14］，用培養(yǎng)皿生物分析法測(cè)定JC-03菌株乙酸乙酯粗提物對(duì)旱田常見(jiàn)的作物如油菜、大豆、西紅柿、辣椒的影響。

1.2.6 JC-03菌株鑒定 采用形態(tài)特征和 DNA測(cè)序相結(jié)合的方法鑒定JC-03菌株。首先觀察JC-03菌株的菌落形態(tài)，挑取少量菌落制片，用生物顯微鏡觀察菌株孢子的形態(tài)特征;同時(shí)，用基因組DNA提取試劑盒提取該菌株的DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增得到的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若條帶明顯，則將擴(kuò)增得到的DNA產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并利用BLAST和MEGA4，將獲得的5.8S rDNA序列在GenBank的核酸序列庫(kù)中進(jìn)行同源性序列分析，確定JC-03菌株的種屬分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 14株昆蟲(chóng)腸道菌粗提物對(duì)反枝莧生長(zhǎng)的抑制作用

14株昆蟲(chóng)腸道菌發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物對(duì)反枝莧的莖和根生長(zhǎng)的抑制結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)供試濃度為100 μg/mL時(shí)，JC-03粗提物對(duì)反枝莧根的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用，其對(duì)反枝莧莖和根的抑制率均大于65%，比同濃度陽(yáng)性對(duì)照2，4-D的抑制效果好。

表1 14株昆蟲(chóng)腸道菌乙酸乙酯粗提物對(duì)反枝莧莖和根生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of ethyl acetate extracts from fourteen insect gut fungi against the growth of A.retroflexus’s stem and root

2.2 JC-03不同極性粗提物對(duì)反枝莧生長(zhǎng)的抑制作用

JC-03不同極性粗提物對(duì)反枝莧的除草活性結(jié)果見(jiàn)表2。從表中數(shù)據(jù)可以看出，JC-03發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物的除草活性最好，其對(duì)反枝莧莖和根的抑制率分別為59.43%和70.02%，說(shuō)明其活性物質(zhì)主要集中在中等極性的乙酸乙酯提取物中。

表2 JC-03不同極性粗提物對(duì)反枝莧莖和根生長(zhǎng)的抑制作用Table 2 Inhibition effect of the strain JC-03’s crude extracts of different polarities against the growth of A.retroflexus’s stem

2.3 JC-03對(duì)作物的安全性測(cè)定

采用培養(yǎng)皿生物分析法，測(cè)定JC-03乙酸乙酯粗提物對(duì)旱田常見(jiàn)作物油菜、大豆、西紅柿、辣椒的安全性，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)供試濃度為100 μg/mL時(shí)，JC-03的乙酸乙酯粗提物對(duì)作物的安全性較好，對(duì)4種作物莖和根的抑制率均低于35%;而同濃度的陽(yáng)性對(duì)照2，4-D對(duì)作物的抑制率較高，對(duì)4種作物莖和根的抑制率大于65%。因此JC-03菌對(duì)作物的抑制作用較小，即對(duì)作物的安全性較高。

表3 JC-03乙酸乙酯粗提物對(duì)4種作物莖和根的抑制作用Table 3 Inhibition effect of ethyl acetate extract from the strain JC-03 against the growth of 4 crops’tem and root

2.4 JC-03 菌種鑒定

圖1 JC-03菌株ITS-5.8S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ITS-5.8S rDNA gene of strain JC-03 PCR products

在MEA培養(yǎng)基上，JC-03菌株菌落呈圓形，質(zhì)地均勻，緊貼平板，菌絲呈絮狀，生長(zhǎng)旺盛，初期呈白色，后期中央菌絲體由白色轉(zhuǎn)為洋蔥紅色或者鮮紅色。采用插片法培養(yǎng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株可產(chǎn)生孢子，大型分生孢子呈卵形或者紡錘形，具3～5個(gè)隔膜，個(gè)別具1～2個(gè)隔膜。利用ITS-5.8S rDNA區(qū)域的通用引物ITSl和ITS4，JC-03菌株的ITS-5.8S rDNA區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜見(jiàn)圖1，片段大小在500～750 bp之間，測(cè)序結(jié)果表明為534 bp。將JC-03菌的5.8S rDNA基因序列與GenBank上已公布的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)JC-03菌與赤霉菌(Gibberella intermedia AB725612)的同源性高達(dá)99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的親緣關(guān)系較近(圖2)。再結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定JC-03菌為赤霉菌(G.intermedia)。

圖2 基于5.8S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株JC-03與赤霉菌屬相關(guān)菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the 5.8S rDNA gene sequences of JC-03 and Gibberella’s related strains

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從多種昆蟲(chóng)腸道中分離得到14株菌，活性篩選表明大黑金龜子腸道菌JC-03的乙酸乙酯粗提物對(duì)反枝莧具有較好的除草活性，且其對(duì)常見(jiàn)作物油菜、大豆、西紅柿和辣椒的安全性較好。因此，JC-03菌具有開(kāi)發(fā)成安全的微生物源除草劑的潛力。

文獻(xiàn)報(bào)道與G.intermedia無(wú)性態(tài)同屬的Fusarium nygamai具有除草活性且其活性成分主要為鐮刀菌酸(fusaric acid)類(lèi)物質(zhì)［15］，分離的 JC-03菌是否有該類(lèi)物質(zhì)或其他活性成分，還有待于后續(xù)的進(jìn)一步研究。另外，對(duì)于該菌的活性作用機(jī)理和田間防效等，也有待于進(jìn)一步的研究探討。

［1］魯萍，梁慧，王宏燕，等.外來(lái)入侵雜草反枝莧的研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2010，29(8):1662-1670.

［2］Petroski R J，Stanley D W.Natural compounds for pest and weed control［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(18):8171-8179.

［3］張朝賢，倪漢文，魏守輝，等.雜草抗藥性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(4):1274-1289.

［4］仉歡，王開(kāi)運(yùn).微生物除草劑研究進(jìn)展［J］.雜草科學(xué)，2010，(2):1-7.

［5］Schraderl K K，Andolfi A，Cantrell C L，et al.A survey of phytotoxic microbial and plant metabolites as potential natural products for pest management［J］.Chemistry ＆ Biodiversity，2010，7(9):2261-2280.

［6］Vurro M，Boari A，Evidente A，et al.Natural metabolites for parasitic weed management［J］.Pest Management Science，2009，65(5):566-571.

［7］Lundgren J G，Lehman R M.Bacterial gut symbionts contribute to seed digestion in an omnivorous beetle［J］.Plos One，2010，5(5):e10831.

［8］Vis?otto L E，Oliveira M G，Guedes R N，et al.Contribution of gut bacteria to digestion and development of the velvetbean caterpillar，Anticarsia gemmatalis［J］.Journal of Insect Physiology，2009，55(3):185-191.

［9］Zhang Y L，Ge H M，Li F，et al.New phytotoxic metabolites from Pestalotiopsis sp.HC02，a fungus residing in Chondracris rosee gut［J］.Chemistry ＆ Biodiversity，2008，5(11):2402-2407.

［10］Zhang Y L，Kong L C，Jiang D H，et al.Phytotoxic and antifungal metabolites from Curvularia sp.FH01 isolated from the gut of Atractomorpha sinens［J］.Bioresource Technology，2011，102(3):3575-3577.

［11］張應(yīng)烙，尹彩萍，葉圣濤.棉蝗腸道真菌Phoma sp.HC03除草和免疫抑制成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2010，22(4):600-602.

［12］胡松英，張應(yīng)烙，黃娟翠，等.白蟻共生放線菌的抗菌活性篩選及菌株BY02的初步鑒定［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31(3):17-20.

［13］Mata R，Bye R，Linares E，et al.Phytotoxic compounds from Flourensia cernua［J］.Phytochemistry，2003，64(1):285-291.

［14］彭文文.灰葡萄孢培養(yǎng)濾液的生物活性及其影響因素［D］.西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.

［15］Vischetti C，Esposito A.Degradation and transformation of a potential natural herbicide in three soils［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(9):3901-3904.