黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性研究

李曉東，周 明，楊麗娜，夏 偉，王 俊，錢利純*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036;2.浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.2;beta-glucosidase)屬于水解酶類，是纖維素酶系中的一種，能水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖。Liebig等(1837)首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶，其后發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界許多植物中。Bongon［1］、Masaru 等［2］、Elias等［3］、汪大受［4］分別從苦杏仁、葡萄、大豆、玉米、黑櫻桃、水稻和大豆中分離純化了β-葡萄糖苷酶。微生物β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、細菌、真菌等微生物［5］。微生物中以木霉和黑曲霉的產(chǎn)量為最高，植物來源的β-葡萄糖苷酶活性一般比微生物來源的酶活力要低［6］。現(xiàn)有資料表明，不同來源的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性不同，存在著較大差異，葉海梅等［7］發(fā)現(xiàn)米曲霉FZ58的β-葡萄糖苷酶的最適作用溫度為60℃，最適作用pH 為5.0;朱鳳妹等［8］、宋成程等［9］認為，黑曲霉β-葡萄糖苷酶最適作用溫度為55℃，最適作用pH 為5.0;而孟憲文等［10］研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌 β-葡萄糖苷酶最適作用溫度和pH為40℃和6.0。β-葡萄糖苷酶在飼料工業(yè)中可作為飼料添加劑，用于分解飼料中的結(jié)合型大豆異黃酮，提高畜禽的生產(chǎn)性能。經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解，將不具活性的大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為活性苷元才能被吸收，進而在體內(nèi)發(fā)揮作用。由于大豆自身含有的內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶水解活性不強(水解效率只有22%～29%)，添加足量的高活性酶(如苦杏仁和酵母中提取β-葡萄糖苷酶)可使水解達到100%［11］。據(jù)Y H Pyo等研究發(fā)現(xiàn)，豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物，都能夠?qū)⒍鼓碳胺鄱鼓讨猩镉行暂^低的異黃酮糖苷高效轉(zhuǎn)化為高活性的異黃酮苷元［12］。畜禽腸道不同部位的pH存在差異，影響β-葡萄糖苷酶的活性;同時，飼料加工過程中的高溫處理也影響酶的活性。因此，研究黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性有助于酶的推廣應(yīng)用，為生產(chǎn)適合養(yǎng)殖業(yè)要求的β-葡萄糖苷酶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

β-葡萄糖苷酶 通過黑曲霉zju2發(fā)酵制得。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的提取及活性測定 準確稱取200 g發(fā)酵干曲，溶于1000 mL pH 5.0的緩沖溶液，搖床振蕩4～6 h，用4層紗布過濾。將浸出物在4℃、5000 r/min離心5 min，棄固體雜質(zhì)，得到的上清液即為粗酶液。對粗酶液的酶活和蛋白質(zhì)含量進行測定。

1.2.2 硫酸銨分級沉淀 準確量取粗酶液的體積后，將其置于盛有冰水混合物的磁力攪拌器中，緩慢加入4℃預(yù)冷的(NH4)2SO4，使飽和度達到30%，即每100 mL粗酶液中添加固體(NH4)2SO416.4 g，30 min內(nèi)加完后，置于4℃過夜，使之完全沉淀。10000×g離心10 min，分離上清液和沉淀，并分別測定上清液和沉淀物中酶活及蛋白質(zhì)含量。準確量取30%(NH4)2SO4沉淀后的上清液體積，將其置于盛有冰水混合物的磁力攪拌器中，緩慢加入4℃預(yù)冷的(NH4)2SO4，使飽和度達到60%，即每100 mL粗酶液中再添加固體(NH4)2SO418.1 g，30 min內(nèi)加完后，置于4℃過夜使之完全沉淀。10000×g離心10 min，分離上清液和沉淀，并分別測定上清液和沉淀物中酶活及蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 Sephadex G-25脫鹽 G-25的粒度為100～200 目之間，滯留水量為(2.5 ±0.25)mL，膨脹體積為4～6 mL。根據(jù)凝膠柱的體積，確定G-25的用量。用0.5 mmol/L pH 5.0磷酸緩沖液與G-25混合，凝膠混合液放于4℃過夜，使凝膠顆粒充分吸水。將處理好的凝膠上柱，用磷酸緩沖液平衡12 h，60%硫酸銨沉淀的酶蛋白質(zhì)溶解在最適pH的磷酸緩沖液中，加樣后，調(diào)節(jié)凝膠柱的流速。用考馬斯亮藍檢測到有蛋白洗脫出時，開始收集洗脫液，選擇比活力高的收集液，進行透析濃縮。將比活高的酶蛋白收集液放入透析袋(分子截流量14000)中，扎緊透析袋兩端，放入平皿中，用蔗糖填充平皿，4℃放置過夜，使酶蛋白液充分濃縮。濃縮后酶蛋白用葡聚糖G-100凝膠層析。

1.2.4 Sephadex G-100凝膠層析 Sephadex G-100凝膠層析其他操作同1.2.3，濃縮后酶蛋白用于酶學(xué)特性研究和蛋白凝膠電泳測分子量。

1.2.5 蛋白凝膠電泳法測定分子量 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量，以5%濃縮膠10%分離膠，90 V恒壓電泳3 h，考馬斯亮藍R250充分染色，用ImageMaster VDS成像系統(tǒng)掃描，得到蛋白圖譜。

1.2.6 酶的最適反應(yīng)溫度 在試管中加入1.2 mL 0.1 mol/L pH 5.0 的檸檬酸緩沖溶液，0.4 mL 8 mmol/L的p-NPG;然后加入酶液0.4 mL，在30～70℃水浴條件下反應(yīng)30 min后，加入2 mL 0.5 mol/L的碳酸鈉，在400 nm處測定吸光值。以溫度為橫坐標，OD值為縱坐標，分析酶活隨溫度的變化曲線。溫度范圍設(shè)定為30～85℃，梯度為5℃，共計12個溫度點。

1.2.7 酶的最適反應(yīng) pH 配制0.2 mol/L，pH 3.0～7.0的系列磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，利用這些緩沖溶液配制一系列底物，在最適溫度(70℃)下反應(yīng)30 min，其他操作同 1.2.6，測 OD 值。

1.2.8 酶的熱穩(wěn)定性 酶液在30～90℃水浴中分別保溫5、15、30、60 min，立即置于冰浴中，在最適反應(yīng) pH 4.5 下，其它操作同1.2.6，測 OD 值。

1.2.9 酶的pH穩(wěn)定性 酶液分別在pH 3.0～9.0的緩沖液中，在最適溫度70℃的水浴鍋中放置0、5、20、40、60 min，其他操作同1.2.6，測 OD 值。

1.2.10 米氏常數(shù)測定 配制濃度分別為1000、2000、3000、4000、5000、6000 μmol/L 的底物，在pH 4、70℃的條件下加入酶液反應(yīng)30 min，測定OD值，根據(jù)對硝基苯酚含量與OD值的標準曲線，計算反應(yīng)速度，采用雙倒數(shù)作圖法，求出Km和Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的提取純化及其分子量

2.1.1 粗提酶液活性 由表1可知，粗提酶液中含有7.26 U/mL的活性，活性較高，適合進行進一步的純化提取。

表1 粗提酶液活性Table 1 The activity of extract enzyme liquid

2.1.2 硫酸銨分級沉淀后酶活性 由表2可知，經(jīng)30%硫酸銨沉淀后，上清液和沉淀物中的酶活基本相近，沒有達到分離純化的目的，再經(jīng)60%硫酸銨沉淀后，沉淀物中酶蛋白含量較多，活性較高，適合用于G-25的脫鹽。

表2 硫酸銨分級沉淀后酶活性Table 2 The activity of ammonium sulfate grade sedimentation

2.1.3 硫酸銨鹽沉淀后β-葡萄糖苷酶脫鹽 對收集的洗脫液進行蛋白含量和活力測定，繪制曲線圖(圖1)。由圖1可知，從第5管開始，收集的洗脫液酶活性和蛋白含量較高，到13管以后，酶活和蛋白含量急劇下降。因此，取5～13管進行洗脫液透析濃縮效果最好。

圖1 β-葡萄糖苷酶脫鹽曲線Fig.1 The curve of enzyme desaliniztion by Sephadex G-25

2.1.4 β-葡萄糖苷酶純化 采用Sephadex G-100進行純化，由圖2可以看出，從5～11管之間收集的洗脫液酶活性和蛋白含量較高，收集第11管的酶液進行透析濃縮，用于電泳分析。

圖2 β-葡萄糖苷酶分離純化曲線Fig.2 The curve of purification of enzyme by Sephadex G-100

2.1.5 SDS-PAGE凝膠電泳 β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE結(jié)果(圖3)表明，與標準蛋白相比，在66.2 ku附近有1條明顯的特異性蛋白質(zhì)條帶。通過分析標準分子量蛋白質(zhì)的分子量對數(shù)(log M)和相對遷移率(μR)之間的關(guān)系(圖4)，建立回歸方程，通過測定和計算β-葡萄糖苷酶條帶的相對遷移率(μR)，代入回歸方程，計算出β-葡萄糖苷酶的分子量為65.20 ku。

圖3 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the product from wild-type

2.2 β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性

2.2.1 酶的最適反應(yīng)溫度 研究表明 (圖5)，黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為70℃;高于70℃，酶活性急劇下降，75和80℃時的酶活性僅為最適反應(yīng)溫度時的54.18%和10.74%，85℃以上，β-葡萄糖苷酶完全失去活性;35和40℃ (接近動物消化道溫度)時的酶活性分別為最適反應(yīng)溫度的27.09%和30.67%;在30～70℃之間，隨溫度的提高，酶活接近直線上升。由此可知，在動物消化道中，黑曲霉β-葡萄糖苷酶并不能完全發(fā)揮酶解的作用，體外酶解以70℃為最佳溫度。

圖4 標準分子量蛋白質(zhì)在相同電泳條件下的分子量對數(shù)(logM)和相對遷移率(μR)之間的關(guān)系Fig.4 Relationship between logarithm(logM)of standard protein molecular weight and the relative front(μR)

圖5 溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.5 Effects of temperatures on β-glucosidase activity

2.2.2 酶的最適反應(yīng)pH 研究表明(圖6)，黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH為4.5～5.0，pH 4.5時酶活性最高;pH低于4.5和高于5.0時，酶活性都急劇下降，pH 4.0和5.5時的酶活性為最適反應(yīng) pH 4.5時活性的 27.84%和56.39%，pH高于7.0時β-葡萄糖苷酶完全失去活性，pH低于3.0也幾乎失去活性;動物胃液中pH一般較低，β-葡萄糖苷酶活性較低，腸道中pH在4.0～6.0之間，β-葡萄糖苷酶能發(fā)揮酶解作用。

2.2.3 酶的熱穩(wěn)定性 β-葡萄糖苷酶在30、40、50、60、70、80和90 ℃條件下分別處理 0 ～60 min發(fā)現(xiàn)(圖7)，處理5 min后活性都不同程度下降，在5 min 時，30、40、50、60 和70 ℃酶活差異不大，但80和90℃條件下酶活很低，90℃時酶已經(jīng)基本滅活，說明80℃以上高溫對酶活性影響很大，短時間就可以使酶失去活性;在30、40、50和60℃條件下，處理15 min后，酶活有所升高，60℃條件下活性最高，70℃條件下酶活比5 min時有所下降，只有60℃條件下酶活的52.55%，80和90℃條件下15 min酶已完全失活;處理30 min后，40、50和60℃條件下酶活有所下降，而30和70℃條件下酶活基本保持15 min時的水平;處理60 min后，30、60和70℃條件下酶活下降，40和50℃條件下反而有所提高，可能與酶的特性有一定關(guān)系;由此可見，β-葡萄糖苷酶在40、50和60℃下穩(wěn)定性較好，而80℃以上不穩(wěn)定。由于飼料在制粒過程中需高溫(80℃左右)處理時間90 s左右，因此可以推測，黑曲霉的β-葡萄糖苷酶在制粒過程中損失可能較大。

圖6 pH對β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.6 Effects of pHs on β-glucosidase activity

圖7 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 The thermal stability of β-glucosidase

2.2.4 酶的pH穩(wěn)定性 在最適反應(yīng)溫度70℃條件下，研究不同pH對β-葡萄糖苷酶活性的影響。研究表明(圖8)，不同pH條件下處理5 min后，酶活都不同程度降低，除pH 9.0緩沖液中酶全部失活外，pH 5.0 酶活性最高，pH 8.0 最低，是最高酶活的50.35%;保溫20 min后，pH分別為3.0和9.0的緩沖液中的酶活基本都失活，而pH為 4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0 的緩沖液中的酶活則相反，都維持較高的酶活，分別是5 min時酶活的91.92%、101.96%、113.16%、112.30% 和101.33%;保溫40 和 60 min，pH 分別為3.0、7.0、8.0、9.0 的緩沖液中的酶完全失活，而 pH 為 4.0、5.0、6.0的緩沖液中的酶活在保溫40 min還維持較高的活性，分別是5 min時酶活的90.70%、95.37%和94.47%，在保溫60 min 后，pH 為4.0、5.0、6.0的緩沖液中的酶活有所下降，分別是5 min 時酶活的 80.49%、95.51%和 78.77%。

圖8 β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性Fig.8 The pH stability of β-glucosidase

結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶在pH分別為3.0、7.0、8.0、9.0 緩沖液中的穩(wěn)定性很差，很容易失活，40 min 基本無活性，在 pH 為 4.0、5.0、6.0 的緩沖液中穩(wěn)定性較好，最低也可維持78.77%的活性，其中在pH為5.0時穩(wěn)定性最好，保溫60 min，酶基本不失活。由于動物的胃中pH較低，一般在3.0左右，β-葡萄糖苷酶基本不發(fā)揮降解作用，腸道中 pH 在4.0 ～7.0 之間，β-葡萄糖苷酶能夠起酶解效用，由此可知，動物小腸是酶起作用的主要部位。

2.2.5 酶的米氏常數(shù) 由圖9可知，β-葡萄糖苷酶的 Km=41.67 mmol/L，Vmax=23.81 U/L。

圖9 β-葡萄糖苷酶米氏常數(shù)雙倒數(shù)作圖法Fig.9 The Lineweaver-Burk(double-reciprocal)plot of β-glucosidase

3 討論

不同來源的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性不同，特別是最適反應(yīng)溫度存在著較大的差異。本研究表明，黑曲霉zju2產(chǎn)β-葡萄糖苷酶分子量為65.20 ku，最適反應(yīng) pH 為 4.5 ～5.0，能夠適應(yīng)腸道中4.0～7.0之間的pH環(huán)境，能夠充分發(fā)揮較好的酶解作用。其最適反應(yīng)溫度為70℃，顯著高于文獻資料的參考溫度，具備有較好的熱穩(wěn)定性能，在30～70℃之間，隨溫度的提高，酶活直線上升，溫度高于70℃時，酶活性急劇下降，85℃時基本失活，該酶耐熱性能有待提高。由于飼料在制粒過程中溫度較高，因此可以推測，黑曲霉zju2產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在制粒過程中損失較大，應(yīng)用于飼料工業(yè)還需要進一步改良。

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