中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素的活性研究

高紅瑾，許云祿，王少明，陳 燕

(1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院，福建省立醫(yī)院，福建 福州350001;2.福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所，福建 福州350004;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)系，福建福州350108)

眼鏡蛇神經(jīng)毒素(Neurotoxin，NT)是中華眼鏡蛇毒中最主要的致死成分，也是最主要的鎮(zhèn)痛成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NT對(duì)醋酸，熱板及電刺激三種藥理模型的研究，探討了江西產(chǎn)眼鏡蛇神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛作用，并通過(guò)其對(duì)離體蛙腹直肌N2受體的阻斷作用，了解其毒性，對(duì)于毒素的產(chǎn)品開發(fā)以及作用機(jī)理的研究有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 江西產(chǎn)中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素NT(電泳純)，由福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)KM小鼠，雌雄兼用，體重18～22 g，由吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCX(閩):20042002;牛蛙，市售。

1.1.3 試劑 硫酸羅通定注射液(廣東省博羅先鋒藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào):080606);氯乙酰膽堿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20080603);鹽酸哌替啶注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào):2120503);維庫(kù)溴銨注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào):13071711);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 RM6240B/C型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，JTC－1型交流電刺激器(成都儀器廠)，HSS－1型恒溫浴槽(成都儀器廠)，JZ101型肌肉張力換能器(北京市朝陽(yáng)區(qū)信達(dá)機(jī)電技術(shù)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 NT量效關(guān)系的測(cè)定(熱板法) 小鼠熱板法［1］取體重18～22 g，12 h禁食不禁水的雌性 KM小鼠，將小鼠放在(55±0.5)℃的恒溫金屬板上，記錄小鼠從放置熱板上到出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的時(shí)間，測(cè)兩次取平均值作為給藥前基礎(chǔ)痛閾值，將基礎(chǔ)痛閾不在5～30 s范圍內(nèi)的小鼠剔除，取75只符合要求小鼠，隨機(jī)分為5組，每組15只，分為中華眼鏡蛇神經(jīng)毒素大劑量組(NT 0.160 mg·kg－1)、中劑量組(NT 0.120 mg·kg－1)、小劑量組(NT 0.060 mg·kg－1)、羅通定組(Rot 50 mg·kg－1)，生理鹽水對(duì)照組(NS 10 mL·kg－1)。各組均腹腔注射，分別測(cè)定NT大劑量組，中劑量組，小劑量組，生理鹽水組腹腔注射后4 h的痛閾，羅通定組測(cè)定給藥后2 h的痛閾。痛閾超過(guò)60 s按60 s計(jì)。計(jì)算痛閾提高百分率。

痛閾提高百分率=［(給藥后痛閾值－給藥前痛閾值)/給藥前痛閾值］×100%

1.2.2 NT時(shí)效關(guān)系的測(cè)定 參照小鼠熱板法，選取合格的KM雌性小鼠30只隨機(jī)分成兩組，每組15只，分別腹腔注射NT 0.12 mg·kg－1和生理鹽水0.1 mL·(10 g)－1，測(cè)定給藥前和給藥后 1、2、3、4、5、6 h各時(shí)間點(diǎn)小鼠的痛閾值，計(jì)算痛閾提高百分率。

1.2.3 小鼠電刺激法觀察NT的鎮(zhèn)痛作用 取18～22 g的KM小鼠，給藥前先進(jìn)行動(dòng)物篩選，將小鼠裝入鼠筒并使其尾巴露出，將交流電刺激儀“刺激方式”調(diào)至“單次”，刺激時(shí)間置于0.6 s，輸出端的兩個(gè)鱷魚夾用生理鹽水潤(rùn)濕，然后分別夾住小鼠尾巴近心端和遠(yuǎn)心端，調(diào)整電壓旋鈕至1 V，開通電源，逐漸增加電壓，以引起小鼠嘶叫電壓值為基礎(chǔ)痛閾，基礎(chǔ)痛閾＞5 V者棄用。將合格的小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分成3組，分別腹腔注射生理鹽水［NS 0.1 mL·(10 g)－1］，哌替啶(Dol 50 mg·kg－1)，神經(jīng)毒素(NT 0.12 mg·kg－1)如超過(guò)50 V 仍無(wú)反應(yīng)者，其痛閾按50 V計(jì)。測(cè)定給藥前，NT組，NS組給藥后5 h小鼠痛閾，Dol組測(cè)定給藥后1 h痛閾，并計(jì)算痛閾提高百分率。

1.2.4 小鼠醋酸扭體法［1］觀察NT鎮(zhèn)痛活性 KM雌性小鼠33只，體重18～22 g，隨機(jī)分成3組，生理鹽水組(NS 10 mL·kg－1)、羅痛定組(Rot 50 mg·kg－1)和神經(jīng)毒素組(NT 0.120 mg·kg－1)，參照文獻(xiàn)方法，NS組、NT組腹腔注射給藥5 h后，Rot組腹腔注射給藥1 h后，每只小鼠按10 mL·kg－1劑量腹腔注射0.8%醋酸，觀察15 min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)，并計(jì)算抑制百分率。抑制百分率=［(生理鹽水組扭體次數(shù)－實(shí)組扭體次數(shù))/生理鹽水組扭體次數(shù)］×100%。

1.2.5 NT對(duì)乙酰膽堿所致蛙體外腹直肌收縮作用的影響 開啟RM6240生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，參數(shù)分別設(shè)定為“肌張力，掃描速度10 s·div－1，靈敏度3 g”。參照文獻(xiàn)方法［2］制備標(biāo)本，置于盛有任氏液10 mL的浴槽中，通以空氣，標(biāo)本加前負(fù)荷1.5～3 g，穩(wěn)定10 min，以累加法向浴槽內(nèi)加入乙酰膽堿描記標(biāo)本收縮曲線，直至標(biāo)本收縮幅度不再隨ACh濃度的增加而增加即達(dá)最大效應(yīng)。用任氏液沖洗標(biāo)本3次，待收縮曲線恢復(fù)到基線后，加入NT作用15 min后，同法加入ACh描記NT存在時(shí)標(biāo)本收縮曲線，以ACh終濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，效應(yīng)百分率為縱坐標(biāo)，繪出ACh引起標(biāo)本收縮的量效曲線，求出給NT前后ACh引起蛙腹直肌收縮的半數(shù)最大有效濃度(EC50和EC50*)，根據(jù) Schild［3］公式計(jì)算 NT對(duì)N2－AChR的解離常數(shù)。EC50

*/EC50－1=I/KD(I:拮抗劑的濃度，KD:解離常數(shù))

同法計(jì)算維庫(kù)溴銨(vecuronium bromide，Vec)的解離常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 NT鎮(zhèn)痛量效關(guān)系(熱板法)結(jié)果表明腹腔NT 0.12 mg·kg－1，0.16 mg·kg－1后4 h 小鼠熱板痛閾明顯提高，痛閾分別提高94.91%和116.77%，與生理鹽水組比較有顯著差異，見表1。

2.2 NT鎮(zhèn)痛時(shí)效關(guān)系(熱板法) 結(jié)果表明腹腔注射 NT 0.12 mg·kg－1后，2 h 痛閾提高 41.13%，與生理鹽水組比較有顯著性差異(P＜0.05)，5 h痛閾達(dá)到最高峰，比基礎(chǔ)痛閾提高118.09%(P＜0.01)，見表2。

表1 NT鎮(zhèn)痛量效關(guān)系(熱板法)(n=15，±s)

表1 NT鎮(zhèn)痛量效關(guān)系(熱板法)(n=15，±s)

注:與 NS組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與給藥前比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量 小鼠熱板痛閾(s)15.34 ±4.14 17.96 ±6.58 0.06 mg·kg－1 17.49 ±5.95 25.84 ±13.35#NT 0.12 mg·kg－1 16.32 ±6.00 31.81 ±17.31*##0.16 mg·kg－1 16.64 ±4.38 36.07 ±19.78*##Rot 50 mg·kg－1 18.12 ±6.70 45.97 ±17.63＊＊##給藥前 給藥后NS 0.1 mL·kg－1

2.3 NT對(duì)電刺激致痛的鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明腹腔注射NT后，1 h痛閾與NS組比較無(wú)顯著差異而5 h小鼠的痛閾提高526.32%，與生理鹽水組比較有顯著差異(P＜0.05)，與Dol組比較起效慢而維持時(shí)間長(zhǎng)，見表3。

表2 NT的鎮(zhèn)痛時(shí)效關(guān)系(熱板法)(n=15，±s)

表2 NT的鎮(zhèn)痛時(shí)效關(guān)系(熱板法)(n=15，±s)

注:與 NS 組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與給藥前比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量 給藥前痛閾(s)給藥后痛閾(s)0 17.96 ±6.58 19.38 ±8.03 19.74 ±7.80 NT 0.12 mg·kg－1 16.32 ±6.00 22.01 ±7.76# 23.03 ±7.55*# 28.10 ±10.81＊＊##31.81 ±17.31*## 35.58 ±16.20＊＊## 35.39 ±17.85*##1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h NS 0.1 mL·(10 g)－115.54 ±4.14 17.15 ±8.61 16.31 ±5.98 16.59 ±8.0

表3 NT的鎮(zhèn)痛活性(電刺激法)(n=10，±s)

表3 NT的鎮(zhèn)痛活性(電刺激法)(n=10，±s)

注:與 NS 組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與給藥前比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量 基礎(chǔ)痛閾(V)給藥后痛閾(V)2.10 ±0.88 1.80 ±0.63 1.90 ±0.74 Dol 50 mg·kg－1 2.10 ±1.10 5.70 ±1.64＊＊##3.40 ±1.27 NT 0.12 mg·kg－1 2.80 ±1.23 5.30 ±3.50 11.90 ±6.97*#1 h 5 h NS 0.1 mL·(10 g)－1

2.4 NT對(duì)醋酸致痛的鎮(zhèn)痛作用結(jié)果 結(jié)果表明腹腔注射NT后5 h，小鼠扭體次數(shù)明顯減少，見表4。

表4 NT對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響(n=11，±s)

表4 NT對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響(n=11，±s)

注:與 NS組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與給藥前比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 劑量 扭體次數(shù) 抑制率(%)47.50 41.73 ±12.13 0 Rot 50 mg·kg－1 18.82 ±6.91＊＊ 54.90 NT 0.12 mg·kg－1 21.91 ±4.66＊＊NS 0.1 mL·(10 g)－1

2.5 NT對(duì)蛙腹直肌N2受體的阻斷作用 結(jié)果表明NT可使ACh所致的蛙腹直肌收縮的量效曲線平行右移，見圖1。用Log(EC50*/EC50－1)對(duì) NT摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)作圖，其斜率接近－1，見圖2。NT濃度為 1 ×10－7mol·L－1，3.2 ×10－7mol·L－1時(shí)，KD 值分別為(5.05 ± 0.27)× 10－2μmol·L－1和(5.20 ±0.93)×10－2μmol·L－1，改變 NT 的濃度其KD值基本不變，NT的KD值取均值5.12×10－2μmol·L－1;Vec 的 KD 值為(3.30 ±0.23)×10－1μmol·L－1，兩者比值 3.30 × 10－1/5.12 × 10－2=6.45，說(shuō)明 NT同 N2受體的親和力約為 Vec的6.45倍。

3 討論

圖1 NT對(duì)ACh所致蛙離體腹直肌收縮的影響(n=3)

圖2 不同濃度NT與Log(EC50*/EC50－1)的關(guān)系

3.1 本實(shí)驗(yàn)對(duì)NT的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行觀察，結(jié)果表明NT具有較明顯的鎮(zhèn)痛活性，對(duì)不同的致痛模型顯示了對(duì)抗作用，具有劑量－效應(yīng)關(guān)系。NT的鎮(zhèn)痛作用起效較慢，腹腔注射后2 h起效，5 h達(dá)到作用高峰。

3.2 不同的測(cè)痛方法所觀察的痛反應(yīng)區(qū)中樞整合部位有所不同［4］。本實(shí)驗(yàn)觀察到NT對(duì)電刺激引起的疼痛效果最好，對(duì)醋酸誘發(fā)的扭體反應(yīng)，對(duì)熱板所致疼痛效果次之。熱板法舔爪的反應(yīng)在低位腦干和脊髓水平進(jìn)行整合，但電刺激小鼠嘶叫反應(yīng)涉及大腦邊緣系統(tǒng)等間腦的整合部位，可以推測(cè)，NT的鎮(zhèn)痛活性可能涉及腦內(nèi)較高的整合部位。蛇毒的鎮(zhèn)痛機(jī)制是十分復(fù)雜可能涉及膽堿能系統(tǒng)［5，6］、NO/cGMP/PKG 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［7～9］、巨噬細(xì)胞活性［10］和內(nèi)源性阿片系統(tǒng)［8，11～13］，說(shuō)明各種蛇毒中存在著許多具有鎮(zhèn)痛作用的不同組分，需要我們進(jìn)一步去研究。

3.3 突觸后神經(jīng)毒素與ACh競(jìng)爭(zhēng)N2－AChR的結(jié)合位點(diǎn)，是N2－AChR的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，可使ACh腹直肌收縮的量效曲線平行右移。突觸前神經(jīng)毒素對(duì)N2－AChR無(wú)作用，所以對(duì)外源性ACh所致的蛙腹直肌收縮的量效曲線無(wú)影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)離體蛙腹直肌實(shí)驗(yàn)的研究，NT使ACh所致的蛙腹直肌收縮的量效曲線平行右移，證明NT是突觸后神經(jīng)毒素。

3.4 神經(jīng)毒素可引起中毒動(dòng)物和人的呼吸肌麻痹和驚厥，NT由于阻斷N2膽堿受體，抑制神經(jīng)－肌肉接頭的沖動(dòng)傳導(dǎo)而致呼吸抑制，這可能與其對(duì)N2膽堿受體很強(qiáng)的拮抗能力相關(guān)。突觸后神經(jīng)毒素與乙酰膽堿以及受體的抗體相比，具有更高的親和力，它們?nèi)叩慕Y(jié)合位點(diǎn)相互重疊但并不完全一樣，因此突觸后神經(jīng)毒素能與乙酰膽堿競(jìng)爭(zhēng)乙酰膽堿受體，并可以阻斷乙酰膽堿所傳遞的神經(jīng)信號(hào)，從而影響機(jī)體的正常生理功能［13］。

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