草木犀香豆素的提取工藝及抑菌活性研究

叢建民，陳鳳清，野俊雙，丁淑旺，王 婷，王 平，孫春玲

白城師范學(xué)院，白城 137000

草木犀［Melilotus officinalis(Linn.)Pall］俗名叫野苜蓿，為豆科(Leguminosae)木犀屬(Melilotas Mill)，一年生或多年生草本植物。在我國分布范圍廣，松嫩平原地帶生長很多。性味苦，涼。其重要價(jià)值藥用成分是香豆素(Coumarin)及其香豆素類化合物，具有抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛、減慢心率等作用，用于脾臟病、絞腸痧、白喉、乳蛾等病癥［1］。由于草木犀具有多種用途和植株抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，被譽(yù)為“寶貝草”，我國《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》和《上海市藥材標(biāo)準(zhǔn)》有所記載。目前國內(nèi)已有香豆素含量測定［2］、香豆素純化分離［3］、香豆素抑菌［4］、香豆素藥用價(jià)值［5］的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對吉林省西部種植的草木犀經(jīng)單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化香豆素提取工藝，測定經(jīng)最優(yōu)提取工藝提取得到的補(bǔ)骨脂素、香豆素、歐前胡素、異歐前胡素的含量［6］，并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)研究，以期為草木犀的綜合開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2010年在白城師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)田采取草木犀地上植株，經(jīng)白城師范學(xué)院初敬華教授鑒定為草木犀(Melilotus officinalis)。室內(nèi)陰干，粉碎后，篩選不同顆粒粉末備用。標(biāo)品補(bǔ)骨脂素(66-97-7)、香豆素(91-64-5)、歐前胡素(482-44-0)、異歐前胡素(482-45-1)購于上海源葉生物科技有限公司;藥敏片(紅霉素、復(fù)方新諾明、阿米卡星、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、氟哌酸、氯霉素等)北京太洋藥業(yè)有限公司;其他試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照張海峰等［4］方法，用無水乙醇溶解精密稱取的香豆素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋100倍。取適量進(jìn)行掃描波長、確定各標(biāo)品紫外下最適宜波長。精密吸取上述對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 分別置于10 mL 棕色量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的對照品溶液，在適宜波長下，測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液吸光值，制備濃度與吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 草木犀中香豆素的提取純化工藝

草木犀莖葉除雜后粉碎成顆粒，用乙醇溶液超聲浸提，回收醇提液，旋轉(zhuǎn)回收乙醇，將浸膏水溶后得到粗提物，用乙酸乙酯萃取，NaHCO3和NaOH溶液調(diào)整pH，回收乙酸乙酯相，得到香豆素類內(nèi)酯組分，揮發(fā)乙酸乙酯后得到干品，低溫保存。

1.2.3 提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1提取劑濃度確定

分別稱取顆粒為0.5～0.63 mm草木犀粉末5 g，置于燒杯中。按料液比為1∶20(g/mL)分別加入濃度為65%、70%、75%、80%、85%、90%乙醇，在60℃水浴中超聲提取20 min后，抽濾。提取兩次后合并上清液，即為草木樨香豆素粗提物。將上清液定容200 mL，用紫外分光光度計(jì)測定 A290、A295、A300、A305。樣本做三個(gè)重復(fù)(下同)。

1.2.3.2 提取溫度的確定

方法同上，結(jié)合 1.2.3.1結(jié)果，在 55、60、65、70、75、80 ℃下，水浴超聲提取。

1.2.3.3 提取時(shí)間的確定

方法同上，結(jié)合1.2.3.2結(jié)果，分別超聲提取15，20，25，30，35，40 min。

1.2.3.4 草木犀顆粒細(xì)度的確定

方法同上，結(jié)合1.2.3.3結(jié)果，稱取顆?？讖綖闉?.075～0.25、0.25～0.5、0.5～0.63、0.63～1、＞1 mm草木犀粉末，超聲提取。

1.2.3.5 料液比的確定

方法同上，結(jié)合1.2.3.4結(jié)果，按照料液比(g/mL)為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 超聲提取。

1.2.4 草木犀香豆素提取工藝正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間四因素對草木犀香豆素提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化，以吸光值為指標(biāo)，擬通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)來確定最佳的提取條件。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

方法同單因素實(shí)驗(yàn)，超聲提取香豆素液，定容200 mL，取少量稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)測定A290、A295、A300、A305。

1.3 香豆素的抑菌實(shí)驗(yàn)

采用圓濾紙片法研究香豆素對細(xì)菌抑菌效果［4］。細(xì)菌由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離傳代而來。將香豆素干品用35%乙醇分別做10倍、50倍稀釋，將濾紙片在樣液中浸泡20 min。菌種制作成菌懸液，涂平板。以藥敏片為陽性對照，滅菌水、35%乙醇陰性對照。培養(yǎng)3～5 d后觀察、拍照，記錄結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

掃描各標(biāo)品溶液波長，在適宜波長下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各標(biāo)品最大吸收波長及回歸方程:

C(補(bǔ)骨脂素濃度)=11.957A290-0.5256(μg/kg)，r=0.9968，說明C與A290線性關(guān)系良好;

C(香豆素濃度)=24.297A295-0.4318(μg/kg)，r=0.9970，說明C與A295線性關(guān)系良好;

C(歐前胡素濃度)=15.667A300-0.0794(μg/kg)，r=0.9989，說明C與A300線性關(guān)系良好;

C(異歐前胡素濃度)=18.96A305-0.1648(μg/kg)，r=0.9996，說明C與A305線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對吸光值的影響

由圖1可見，不同乙醇濃度對香豆素提取率影響不同，乙醇濃度為90%時(shí)，吸光值最大，對香豆素的提取率最高;相比之下85%乙醇對香豆素的提取量的影響與90%乙醇提取效率最接近。乙醇濃度越高，揮發(fā)性越大。綜合考慮，選取85%乙醇為最佳提取濃度。

圖1 不同乙醇濃度的對香豆素得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of coumarin

2.2.2 提取溫度對吸光值的影響

由圖2可見，溫度對香豆素得率有一定影響。在55～70℃之間，隨著溫度的升高，吸光值呈現(xiàn)升高，而在70～80℃之間，提取率呈現(xiàn)降低的趨勢。在70℃時(shí)吸光值最大，香豆素的得率最高，故選取70℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對香豆素得率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction yield of coumarin

2.2.3 提取時(shí)間對吸光值的影響

圖3為不同提取時(shí)間對香豆素得率的影響。由圖3可見，隨著時(shí)間的延長得率逐漸增大。提取時(shí)間為35、40 min時(shí)，得率最大，故確定35 min為香豆素的最佳提取時(shí)間。

圖3 不同提取時(shí)間對香豆素得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield of coumarin

2.2.4 顆粒細(xì)度對吸光值的影響

通過圖4可明顯看出，材料的不同顆粒細(xì)度對香豆素提取率有非常明顯的影響。顆粒的越小，香豆素得率越高。顆粒大小為0.075～0.25 mm時(shí)提取率最大。顆粒太小不便于粉碎，且濾液中含有殘?jiān)s質(zhì)，顆粒太大，有效成分未能充分浸提出來?？梢娮罴烟崛☆w粒細(xì)度為0.075～0.25 mm。

圖4 不同顆粒細(xì)度的香豆素得率的影響Fig.4 Effect of particle size on extraction yield of coumarin

2.2.5 料液比對吸光值的影響

通過圖5可以看出，料液比對香豆素提取率有一定程度的影響。料液比為1∶25和1∶35時(shí)，吸光值都很高，香豆素得率很大，綜合考慮，確定1∶25為最佳料液比。

圖5 不同料液比對香豆素得率的影響Fig.5 Effect of liquid ratio on extraction yield of coumarin

2.3 正交實(shí)驗(yàn)分析

通過正交實(shí)驗(yàn)，補(bǔ)骨脂素、香豆素、歐前胡素、異歐前胡素得率如表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal test

4 2 1 2 3 0.296 0.259 0.241 0.231 5 2 2 3 1 0.251 0.229 0.216 0.203 6 2 3 1 2 0.284 0.246 0.233 0.216 7 3 1 3 2 0.265 0.233 0.217 0.206 8 3 2 1 3 0.246 0.228 0.215 0.202 9 3 3 2 1 0.308 0.279 0.260 0.245

2.3.1 補(bǔ)骨脂素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果主次關(guān)系、方差分析

結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對補(bǔ)骨脂素主次關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。

表3 補(bǔ)骨脂素提取結(jié)果分析Table 3 Analysis of extraction conditions using extraction yield of psoralen as index

對補(bǔ)骨脂素的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance

通過正交分析得出，影響補(bǔ)骨脂素提取的各因素間對提取率差異不顯著。主次因素為溫度＞料液比＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度。提取補(bǔ)骨脂素的最佳工藝參數(shù)為溫度75℃，料液比為1∶25，超聲時(shí)間為40 min，乙醇濃度為80%。

2.3.2 香豆素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果主次關(guān)系、方差分析結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對香豆素主次關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示。

表5 香豆素提取結(jié)果分析Table 5 Analysis of extraction conditions using extraction yield of coumarin as index

香豆素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析，結(jié)果如表6所示。

表6 方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance

通過正交分析影響香豆素提取的各因素間對提取率差異不顯著。分析得出影響提取率主次因素為溫度＞料液比＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度。提取香豆素的最佳工藝參數(shù)為溫度75℃，料液比為1∶25，超聲時(shí)間為40 min，乙醇濃度為80%。

2.3.3 歐前胡素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果主次關(guān)系、方差分析

通過分析得出影響歐前胡素提取主次因素為溫度＞料液比＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度。提取香豆素的最佳工藝參數(shù)為溫度75℃，料液比為1∶25，超聲時(shí)間為40 min，乙醇濃度為80%。

表7 歐前胡素提取結(jié)果分析Table 7 Analysis of extraction conditions using extraction yield of imperatorin as index

表8 方差分析結(jié)果Table 8 Analysis of variance

2.3.4 異歐前胡素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果主次關(guān)系、方差分析

表9 異歐前胡素提取結(jié)果分析Table 9 Analysis of extraction conditions using extraction yield of isoimperatorin as index

表10 方差分析結(jié)果Table 10 Analysis of variance

通過分析得出影響異歐前胡素提取主次因素為溫度＞料液比＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間。提取香豆素的最佳工藝參數(shù)為溫度75℃，料液比為1∶25，超聲時(shí)間為40 min，乙醇濃度為80%。

2.3.5 因素效應(yīng)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)分析溫度、料液比對提取效果影響較大，而乙醇、超聲時(shí)間同比下影響較小。與單因素最優(yōu)結(jié)果有差異，說明正交實(shí)驗(yàn)中各因子間有交互作用。綜合考慮，提取香豆素在溫度75℃，料液比為1∶25，超聲時(shí)間為40 min，乙醇濃度為80%下，補(bǔ)骨脂素、香豆素、歐前胡素、異歐前胡素均有較好的提取效果。

驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)在上述最優(yōu)條件下，補(bǔ)骨脂素為721.92 mg/kg，香豆素為425.88 mg/kg，歐前胡素為165.73 mg/kg，異歐前胡素為182.49 mg/kg。

2.4 草木犀香豆素提純

草木犀經(jīng)浸提后得到粗提溶液，采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取純化，進(jìn)行香豆素分離。最終確定NaHCO3濃度5%和NaOH濃度1%下，提純效率最佳。得到香豆素類內(nèi)酯成分后，揮發(fā)乙酸乙酯得到干品，用35%乙醇溶解，低溫保存。提純后補(bǔ)骨脂素含量為613.63 mg/kg，香豆素為362.00 mg/kg，歐前胡素為140.87 mg/kg，異歐前胡素為155.12 mg/kg。

圖6 草木犀香豆素提取液抑制細(xì)菌作用Fig.6 Antibacterial activity of M．officinalis extract

2.5 抑菌效果

由圖6可見，陰性對照組無抑菌效果，陽性對照抑菌效果明顯最高，總香豆素10倍稀釋液的抑菌效果高于50倍稀釋液抑菌效果，10倍稀釋液抑菌效果低于陽性對照組。說明香豆素具有抑制這些菌種生長繁殖的活性。

3 結(jié)論

3.1 草木犀香豆素的單因素提取工藝

通過單因子實(shí)驗(yàn)可以看出，不同乙醇濃度、料液比、溫度、超聲提取時(shí)間、顆粒細(xì)度對香豆素得率的影響不同。乙醇濃度為85%、溫度為70℃、超聲提取時(shí)間為35 min、顆粒細(xì)度為0.075～0.25 mm、料液比為1∶25時(shí)，單因素提取工藝為最佳。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)提取香豆素

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取香豆素工藝。結(jié)果溫度75℃，料液比為1∶25，超聲時(shí)間為40 min，乙醇濃度為80%為優(yōu)化工藝。在此條件下，補(bǔ)骨脂素、香豆素、歐前胡素、異歐前胡素均有較好的提取效果。補(bǔ)骨脂素含量約為721.92 mg/kg，香豆素含量約為425.88 mg/kg，歐前胡素含量約為165.73 mg/kg，異歐前胡素含量約為182.49 mg/kg。

3.3 草木犀香豆素提純

草木犀經(jīng)浸提后，采用乙酸乙酯萃取法，并進(jìn)行香豆素分離。確定NaHCO3濃度5%和NaOH濃度為1%時(shí)，純化最佳。得到香豆素類內(nèi)酯成分后，揮發(fā)掉乙酸乙酯后得到干品，用35%乙醇溶解，低溫保存。補(bǔ)骨脂素為613.63 mg/kg，香豆素為362.00 mg/kg，歐前胡素為140.87 mg/kg，異歐前胡素為155.12 mg/kg。

3.4 草木犀香豆素抑菌實(shí)驗(yàn)

利用濾紙片法進(jìn)行了香豆素抑菌實(shí)驗(yàn)。香豆素10倍稀釋液和50倍稀釋液對土壤細(xì)菌有抑制作用，低濃度香豆素液抑菌效果高于高濃度。

1 The Pharmacopoeia of the people's Republic of China(中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會).The people's Republic of China Ministry of health drug standard of Tibetan medicine(Book 1).Beijing:Chemical Industry Press，1995.65.

2 Tao JY(陶君彥)，Yang AS(楊安樹)，Zhu J(朱江)，et al.不同采收時(shí)間和藥用部位草木樨藥材中香豆素含量的測定.Chin J Hosp Pharm(中國醫(yī)院藥學(xué)雜志)，2010，30:1503-1505.

3 Tao JY(陶君彥)，F(xiàn)eng QL(馮其麟)，Zhang BH(張寶徽)，et al.Study on the extraction，isolation and purification of coumarin in Melilotus suaveolens Leded.Chin J Hospital Pharm(中國醫(yī)院藥學(xué)雜志)，2008，28:1173-1177.

4 Zhang HF(張海峰)，Gao CF(高成富)，Lu XY(盧柳燕)，et al.Preparation and antibacterial effect of Melilotus suaveolens extract system.J Chin Med Mater(中藥材)，2009，32:131-134.

5 Wu MQ(吳木琴).Research on herbs and herbal extracts of the total coumarin in Melilotus pharmaceutical.Hubei:Hubei University of Chinese Medicine，MD，2007.

6 Wu MM(吳明明)，F(xiàn)u MZ(付明哲)，Song XP(宋曉平).Determination of the oil-water partition coefficient of hymecromone by UV spectrophotometry.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2010，38:11985-11986.