高效液相色譜光化學(xué)在線衍生技術(shù)在11種磺胺藥物殘留檢測中的應(yīng)用

陳萬勤等

摘要：建立了磺胺藥物殘留的高效液相色譜光化學(xué)在線衍生熒光檢測方法，并應(yīng)用于豬肉的檢測。樣品經(jīng)過乙腈提取，色譜柱分離后，通過在線光化學(xué)衍生后，用熒光檢測器進行直接檢測。優(yōu)化后的色譜條件：Eclipse Plus C18柱（250 mm × 4.6 mm， 5.0 μm），流動相為均含0.2%甲酸的乙腈、甲醇和水梯度洗脫，檢測激發(fā)波長為248 nm，發(fā)射波長為350 和412 nm。各種磺胺在各自濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R2>0.999，回收率在85.7%～101.1%之間，RSD為1.9%～6.6%（n=6），各磺胺的檢出限（S/N=3）為0.2～3.0 μg/kg，定量限（S/N=10）為0.5～10.0 μg/kg。

關(guān)鍵詞：光化學(xué)在線衍生；高效液相色譜熒光檢測法；磺胺

1引言

磺胺（Sulfonamides， SAs）是一類廣譜抗菌藥物，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)，是預(yù)防和治療細菌感染性疾病的化學(xué)藥物?；前奉愃幬镞€用于馬、牛的傳染性腦膜炎，羊下痢、豬下痢和弓形體病，并且對于禽類球蟲病具有較好療效[1]。由于養(yǎng)殖業(yè)中磺胺類藥物的使用導(dǎo)致了動物源性食物中殘留，從而危害人體健康[2，3]。我國和歐盟均規(guī)定了磺胺在動物組織中的最高殘留限量[4，5]。動物組織中磺胺的檢測方法主要有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6～8]，液相色譜紫外檢測法[9～11]，液相色譜熒光檢測法[12，13]?；前奉愃幬镒陨聿痪哂袩晒饣钚裕捎脽晒鈾z測法時通常需要進行柱前或柱后化學(xué)試劑衍生才能進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，磺酰胺基是光化學(xué)活性基團，在紫外光照射下會發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)物具有熒光性質(zhì)，通過熒光光度法可以對其進行檢測[14～17]。最近研制出一種光化學(xué)在線衍生器，應(yīng)用于高效液相色譜后，可以進行在線光化學(xué)衍生使分子產(chǎn)生熒光活性，利用熒光檢測器可以有效地檢測[18，19]。相比于柱前或柱后化學(xué)試劑衍生法，光化學(xué)衍生不需要額外的衍生化試劑，也不需要柱后衍生反應(yīng)的試劑泵，減少了人工操作，同時也避免衍生化過程中人為操作因素帶來的誤差。光化學(xué)衍生不引入其他雜質(zhì)，減少了人體與有毒試劑的接觸和曝露，更加綠色、環(huán)保、簡便、快捷。到目前為止，關(guān)于光化學(xué)柱后衍生高效液相色譜熒光法在磺胺類藥物檢測上的應(yīng)用尚未見報道。本實驗系統(tǒng)研究了光化學(xué)衍生的實驗條件，建立了簡便，可靠，靈敏度高的動物組織中磺胺藥物殘留的檢測方法。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀配熒光檢測器（美國Agilent公司）；光化學(xué)衍生器（由紫外燈（11 W）、聚四氟乙烯反應(yīng)管（25 m×0.25 mm）組成，北京華安麥科公司）；高速勻漿機（德國IKA公司）；高速離心機（美國Thermo公司產(chǎn)品）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；氮氣吹干儀（天津市恒奧科技有限公司）；渦旋混合器（太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜級， 德國Merck公司）；甲酸、正己烷（色譜級， 美國TEDIA公司）；實驗用水為MilliQ超純水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：磺胺嘧啶（純度≥99.5%），磺胺噻唑（純度≥99.5%），磺胺甲基嘧啶（純度≥99.2%），磺胺吡啶（純度≥99.0%），磺胺二甲基嘧啶（純度≥99.0%），磺胺對甲氧嘧啶（純度≥98.0%），磺胺氯噠嗪（純度≥99.0%），磺胺甲氧噠嗪（純度≥99.2%），磺胺二甲異噁唑（純度≥98.0%），磺胺苯甲酰（純度≥99.0%），磺胺喹噁啉（純度≥98.0%）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

3.2高效液相色譜條件的優(yōu)化

參考磺胺檢測的相關(guān)文獻[9～11]，使用甲醇、乙腈、乙酸溶液三相作為流動相，對比了甲醇、乙腈為有機相與含不同濃度的乙酸溶液組成的流動相對磺胺藥物分離的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，不含酸的流動相，磺胺的藥物的色譜峰形出現(xiàn)拖尾，部分組分重疊。加入乙酸后，色譜峰形對稱，分離效果好?？疾炝瞬煌瑵舛纫宜釋ιV峰形的影響，發(fā)現(xiàn)0.2% 乙酸既能保證較好的分離效果，同時也不影響色譜柱的使用壽命。由于乙腈的洗脫能力較強，磺胺藥物在色譜柱上的保留時間短，部分磺胺分離度較差，甲醇的洗脫能力較弱，分離度好，但是磺胺藥物的保留時間較長，且峰型較扁平。采用合適的甲醇、乙腈、乙酸可得到較好的分離度和較快的分離效率。優(yōu)化后的色譜分離條件見2.2節(jié)，11種磺胺的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

3.3前處理方法的建立

比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯的提取效果。甲醇的提取效率較低，也不易沉淀蛋白。乙酸乙酯提取有利于下一步的處理，但是提取物的脂肪含量較高，除脂過程很容易損失目標(biāo)物。乙腈的提取效率較高，而且提取液的脂肪含量較少，處理也相對方便。乙腈提取液帶入的少量脂肪可以用正己烷去除，盡量減少基質(zhì)的干擾，圖2為凈化后空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖。

3.5回收率和精密度

對陰性豬肉樣品進行回收率實驗，添加水平分別為定量限的3倍和5倍，采用優(yōu)化后的前處理方法對樣品進行處理，每個添加水平重復(fù)6次，各磺胺的平均回收率在85.7%～101.1%之間，RSD為1.9%～6.6%，詳見表2。

3.6實際樣品測定

利用本方法測定了購于農(nóng)貿(mào)市場的10個豬肉樣品中的磺胺類藥物殘留量。在10個樣品中，僅有1例樣品檢出磺胺二甲嘧啶，測得量為24.5 μg/kg （n=3）。結(jié)果表明，本方法相比于常規(guī)化學(xué)試劑衍生檢測法具有綠色、環(huán)保、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，適用于肌肉組織中磺胺藥物殘留的檢測。

References

1BotsoglouN A， Fletouris D J. Drug Residues in Foods： Pharmacology， Food Safety and Analysis， Marcel Dekker， New York， 2001： 27-35

2Sigel C W， Woolley J L， Nichol C A. J. Pharm. Sci.， 1975， 64（6）： 973-976

3UnruhJ， Piotrowski E， Schwartz D P， Barford R. J. Chromatogr.， 1990， 519（1）： 179-187

4Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China， 235th Bulletin， 2002

5Council Regulation （EEC） no. 2377/90 of 26 June 1990， Off. J. Eur. Commun. L224 （1990）14

6Lopes R P， Augusti D V， Souza L F， Santos F A， Lima J A， Vargas E A， Augusti R. Anal. Methods， 2011， 3： 606-613

7PANG GuoFang， CAO YanZhong， ZHANG JinJie， JIA GuangQun， FAN ChunLin， LI XueMin， LIU YongMing， SHI YuQiu. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（8）： 1102-1106

8ZHANG HaiQi， SONG LiLi， XU XiaoLin， HE ZhongYang， ZHANG ChenHui， HOU JingDe. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（2）： 268-272

9WANG ChongYang， WANG YuanPeng， WANG Ning， JIANG ChunZhu， YU Xi， SONG DaQian， SUN Ying. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 83-87

10Sun H W， Ai L F， Wang F C. Chromatographia， 2007， 66： 333-337

11FANG BingHu， HE QiXia， Zou WeiLi， CHEN JianXin，DENG GuoDong， XIAO TianAn， WU QiuHao， LIN HaiDan. Journal of Instrumental Analysis， 2007， 26（4）： 519-522

12Wang L L， Wu J， Wang Q， He C H， Zhou L， Wang J， Pu Q S. J. Agric. Food Chem.， 2012， 60（7）： 1613-1618

13Zotou A， Vasiliadou C. J. Sep. Sci.， 2010， 33（1）： 11-22

14XUN LiPing， XU JinGou. Chinese J. Anal. Chem.， 1992， 20（5）： 499-503

15Snchez Pea M， Muoz de la Pea A， Salinas F， Mahedero M C， Aaron J J. Analyst， 1994， 119： 1177-1181

16LI ManXiu， ZHANG HongLi. Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2010， 29（5）： 79-81

17Flores J L， Fernández de Córdova M L， Díaz A M. Anal. Chim. Acta， 2007， 600（12）： 164-171

18Quinto M， Spadaccino G， Palermo C， Centonze D. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（49）： 8636-8641

19Muscarella M， Iammarino M， Nardiello D， Lo Magro S， Palermo C， Centonze D， Palermo D. Food Addit. Contam.： Part A， 2009， 26（10）： 1402-1410

2Sigel C W， Woolley J L， Nichol C A. J. Pharm. Sci.， 1975， 64（6）： 973-976

3UnruhJ， Piotrowski E， Schwartz D P， Barford R. J. Chromatogr.， 1990， 519（1）： 179-187

4Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China， 235th Bulletin， 2002

5Council Regulation （EEC） no. 2377/90 of 26 June 1990， Off. J. Eur. Commun. L224 （1990）14

6Lopes R P， Augusti D V， Souza L F， Santos F A， Lima J A， Vargas E A， Augusti R. Anal. Methods， 2011， 3： 606-613

7PANG GuoFang， CAO YanZhong， ZHANG JinJie， JIA GuangQun， FAN ChunLin， LI XueMin， LIU YongMing， SHI YuQiu. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（8）： 1102-1106

8ZHANG HaiQi， SONG LiLi， XU XiaoLin， HE ZhongYang， ZHANG ChenHui， HOU JingDe. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（2）： 268-272

9WANG ChongYang， WANG YuanPeng， WANG Ning， JIANG ChunZhu， YU Xi， SONG DaQian， SUN Ying. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 83-87

10Sun H W， Ai L F， Wang F C. Chromatographia， 2007， 66： 333-337

11FANG BingHu， HE QiXia， Zou WeiLi， CHEN JianXin，DENG GuoDong， XIAO TianAn， WU QiuHao， LIN HaiDan. Journal of Instrumental Analysis， 2007， 26（4）： 519-522

12Wang L L， Wu J， Wang Q， He C H， Zhou L， Wang J， Pu Q S. J. Agric. Food Chem.， 2012， 60（7）： 1613-1618

13Zotou A， Vasiliadou C. J. Sep. Sci.， 2010， 33（1）： 11-22

14XUN LiPing， XU JinGou. Chinese J. Anal. Chem.， 1992， 20（5）： 499-503

15Snchez Pea M， Muoz de la Pea A， Salinas F， Mahedero M C， Aaron J J. Analyst， 1994， 119： 1177-1181

16LI ManXiu， ZHANG HongLi. Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2010， 29（5）： 79-81

17Flores J L， Fernández de Córdova M L， Díaz A M. Anal. Chim. Acta， 2007， 600（12）： 164-171

18Quinto M， Spadaccino G， Palermo C， Centonze D. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（49）： 8636-8641

19Muscarella M， Iammarino M， Nardiello D， Lo Magro S， Palermo C， Centonze D， Palermo D. Food Addit. Contam.： Part A， 2009， 26（10）： 1402-1410

2Sigel C W， Woolley J L， Nichol C A. J. Pharm. Sci.， 1975， 64（6）： 973-976

3UnruhJ， Piotrowski E， Schwartz D P， Barford R. J. Chromatogr.， 1990， 519（1）： 179-187

4Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China， 235th Bulletin， 2002

5Council Regulation （EEC） no. 2377/90 of 26 June 1990， Off. J. Eur. Commun. L224 （1990）14

6Lopes R P， Augusti D V， Souza L F， Santos F A， Lima J A， Vargas E A， Augusti R. Anal. Methods， 2011， 3： 606-613

7PANG GuoFang， CAO YanZhong， ZHANG JinJie， JIA GuangQun， FAN ChunLin， LI XueMin， LIU YongMing， SHI YuQiu. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（8）： 1102-1106

8ZHANG HaiQi， SONG LiLi， XU XiaoLin， HE ZhongYang， ZHANG ChenHui， HOU JingDe. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（2）： 268-272

9WANG ChongYang， WANG YuanPeng， WANG Ning， JIANG ChunZhu， YU Xi， SONG DaQian， SUN Ying. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 83-87

10Sun H W， Ai L F， Wang F C. Chromatographia， 2007， 66： 333-337

11FANG BingHu， HE QiXia， Zou WeiLi， CHEN JianXin，DENG GuoDong， XIAO TianAn， WU QiuHao， LIN HaiDan. Journal of Instrumental Analysis， 2007， 26（4）： 519-522

12Wang L L， Wu J， Wang Q， He C H， Zhou L， Wang J， Pu Q S. J. Agric. Food Chem.， 2012， 60（7）： 1613-1618

13Zotou A， Vasiliadou C. J. Sep. Sci.， 2010， 33（1）： 11-22

14XUN LiPing， XU JinGou. Chinese J. Anal. Chem.， 1992， 20（5）： 499-503

15Snchez Pea M， Muoz de la Pea A， Salinas F， Mahedero M C， Aaron J J. Analyst， 1994， 119： 1177-1181

16LI ManXiu， ZHANG HongLi. Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2010， 29（5）： 79-81

17Flores J L， Fernández de Córdova M L， Díaz A M. Anal. Chim. Acta， 2007， 600（12）： 164-171

18Quinto M， Spadaccino G， Palermo C， Centonze D. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（49）： 8636-8641

19Muscarella M， Iammarino M， Nardiello D， Lo Magro S， Palermo C， Centonze D， Palermo D. Food Addit. Contam.： Part A， 2009， 26（10）： 1402-1410