集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統(tǒng)

趙樹彌+朱靈+朱燦燦等

摘要集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統(tǒng)將核酸提取、PCR擴增與實時熒光檢測進行整合，在同一塊微流控芯片上實現(xiàn)了核酸分析過程的全自動和全封閉，具有試劑用量少、分析速度快、操作簡便等優(yōu)點。本研究采用微機械加工技術(shù)制作集成核酸提取微流控芯片的陽極模，使用組合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片，與玻璃基底通過等離子體鍵合封裝成集成核酸提取芯片。構(gòu)建了由微流體速度可調(diào)節(jié)（0～10 mL/min）的驅(qū)動控制裝置、溫控精度可達0.1 ℃的TEC溫控平臺、CCD檢測功能模塊等組成的微全分析系統(tǒng)。以人類血液裂解液為樣品，采用硅膠膜進行芯片上核酸提取。系統(tǒng)根據(jù)設(shè)置好的時序自動執(zhí)行，以2 mL/min的流體驅(qū)動速度完成20 μL裂解液上樣、清洗； 以1 mL/min的流體驅(qū)動速度完成DNA洗脫，抽取PCR試劑與之混合注入到反應(yīng)腔。提取的基因組DNA以鏈上內(nèi)參基因GAPDH為檢測對象，并以傳統(tǒng)手工提取為對照，在該系統(tǒng)平臺上進行PCR擴增和熔解曲線分析實驗。片上PCR擴增結(jié)果顯示，擴增曲線明顯，Ct值分別為25.3和26.9。擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析得到的熔解溫度一致，均為89.9 ℃。結(jié)果表明，此系統(tǒng)能夠自動化、全封閉的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR擴增與實時定量分析。關(guān)鍵詞核酸提??； 微全分析系統(tǒng)； 實時熒光PCR； 微流控芯片

核酸作為基本的遺傳物質(zhì)，攜帶著各種信息，對其結(jié)構(gòu)、功能的認識，有利于研究物種的遺傳、進化以及疾病診斷等[1]。微流控芯片在核酸分析方面有著廣泛和極其重要的應(yīng)用，如基因突變檢測[2]、病原體基因鑒定[3，4]、SNP（Single nucleotide polymorphism）分析[5]等。傳統(tǒng)的PCR（Polymerase chain reaction）技術(shù)雖然能實現(xiàn)DNA的擴增檢測，但其檢測結(jié)果受人為因素的影響較大，需要專業(yè)技術(shù)人員和實驗室設(shè)備，而熒光定量PCR技術(shù)和微流控技術(shù)的相結(jié)合，能實現(xiàn)核酸操作過程的自動化、全封閉，簡化了人工的操作過程，避免了過程污染，提高了核酸檢測的效率和準確性[6～8]。集成核酸提取功能的實時熒光PCR微全分析系統(tǒng)將樣品前處理、PCR擴增與熒光檢測功能模塊集成，能直接給出分析結(jié)果，可實現(xiàn)“樣品進結(jié)果出”這一目標。因此，微全分析系統(tǒng)現(xiàn)已成為分析儀器和分析科學發(fā)展的重要方向和前沿[9～11]。

集成化的微流控芯片通常將微流體控制與分析單元集成在芯片上，如微泵、微閥、微加熱器、微混合器、微流量控制器以及微檢測器等，使體積微型化和功能集成化，在較短時間內(nèi)精確完成從樣品制備到結(jié)果顯示的全部過程[12～14]。盡管大規(guī)模集成的微全分析系統(tǒng)還處在實驗室研究階段，但隨著微流控芯片的運用與發(fā)展[15～17]，針對特定功能的微流控芯片及系統(tǒng)發(fā)展迅速[18，19]，如靜態(tài)腔式微流控PCR系統(tǒng)[20]、具有樣品前處理功能的核酸提取系統(tǒng)[21，22]、集成化的溫控系統(tǒng)[23]、微型化的檢測系統(tǒng)[24]。目前，由于各功能模塊的研究突破，促進了集成化的發(fā)展，但形成一個完整的集成化系統(tǒng)還存在著很大的技術(shù)難度[25，19]。

本實驗基于固相萃取法[26]，采用硅膠膜提取核酸[27]，設(shè)計并制作了集成核酸提取的微流控芯片。使用自主研發(fā)的實時熒光PCR微全分析系統(tǒng)，成功提取了人全血中的基因組DNA，對基因組上穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH）進行PCR擴增檢測。開展了傳統(tǒng)手工提取核酸的對照試驗，通過對比，驗證了集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統(tǒng)的可行性，實現(xiàn)了在同一塊微流控芯片上完成核酸的提取與分析過程。2實驗部分

2.1芯片設(shè)計與制作

通過微機械加工技術(shù)[28]在一個很小體積的金屬塊上加工各種微小型腔體，然后把它們作為一個鑲塊嵌入模板并進行整體組裝，組裝成的模具示意圖如圖1A所示，模具尺寸為40 mm×50 mm×10 mm，制作芯片的實物如圖1B所示。C1是Buffer Aw1試劑腔，C2是Buffer Aw2試劑腔，C4是AE試劑腔，C5是PCR反應(yīng)試劑腔，C1～C3的體積均為110 μL，C4～C6的體積均為50 μL；E是50 μL的提取腔；W是224 μL的廢液腔；M是50 μL的混合腔；扁平形的PCR反應(yīng)腔體積為20 μL。

圖1模具示意圖（A）和集成核酸提取芯片（B）

Fig.1Schematic diagram of chip mold （A） and integrated DNA extraction chip （B）核酸提取芯片的制作采用模具組合法[29，30]生成，這不僅便于微小型腔的微細加工和鑲塊的更換，而且能夠提高模具整體的使用壽命。嵌入體在PDMS膠水（Sylgard 184， DowCorning）中構(gòu)成3D結(jié)構(gòu)，這種3D的通道可以像立交橋分層相互獨立貫穿整個空間，實現(xiàn)了真正意義上的3D通道。固化后的PDMS 表面具有一定的粘附力， 可借助分子間的引力自然與玻璃基板進行粘合， 但這種粘合強度有限， 容易發(fā)生漏液。本研究采用氧等離子體鍵合的方法[31]處理PDMS 芯片與玻璃基片35 s，改善了PDMS和玻璃表面活性，然后貼合放置在90 ℃的恒溫箱烘烤30 min，使芯片成為永久性粘合。分 析 化 學第42卷第10期趙樹彌等： 集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統(tǒng)

2.2芯片的驅(qū)動控制

微機械加工技術(shù)在芯片上制備出精細和復雜的幾何通道結(jié)構(gòu)，可利用通道自身特性和特征進行微流體的流動控制[32]。由于微通道中表面積與體積之比非常大，表面效應(yīng)極大影響流體流動，給微流體驅(qū)動和控制帶來了困難。芯片上的操作過程包括細胞裂解液加載，硅膠膜上DNA吸附、清洗、洗脫，反應(yīng)試劑的混合以及PCR反應(yīng)。在對微流體特性進行深入分析的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一套相應(yīng)的驅(qū)動控制裝置。硬件設(shè)備主要包括FPGA核心電路板、陣列電磁閥、氣體質(zhì)量流量控制器、微型真空泵。陣列電磁閥上配置壓力傳感器和減壓閥；微真空泵的最大真空度為60 kPa， 最大流速為15 L/min；氣體質(zhì)量流量控制器的對流體的流速控制范圍在0～10 mL/min。FPGA電路控制陣列電磁閥為芯片上流體的操控提供時序控制， 外置氣動泵和流量控制器對微流體進行可調(diào)節(jié)的驅(qū)動和控制。

2.3實時熒光PCR分析裝置

實時熒光定量PCR分析裝置集成了三大功能模塊： 工控機、CCD熒光檢測模塊和半導體溫控模塊，如圖2A所示。工控機控制系統(tǒng)是分析平臺的操控中心，不僅協(xié)調(diào)各模塊的操作控制，還對數(shù)據(jù)進行處理分析。CCD熒光檢測模塊的總體性能將影響整個分析系統(tǒng)的檢出限、檢測速度、適用范圍等指標[24]， 其結(jié)構(gòu)如圖2B所示，主要由微流控芯片、LED光源、CCD探測器三部分組成。CCD探測器性能以熒光素鈉模擬測試達到了5×1010mol/L，實現(xiàn)了高靈敏度的探測。溫控是PCR正常進行的關(guān)鍵，溫控的準確性決定了PCR擴增的成敗。本實驗采用半導體制冷器（TEC）來控制微流控PCR芯片的溫度，通過PID算法[33]來實現(xiàn)溫度循環(huán)的快速準確控制，溫控平臺如圖2C所示。PCR溫控系統(tǒng)升溫速率為7.2 ℃/s，降溫速率為5 ℃/s，溫控精度達到了0.1 ℃，完全能夠滿足PCR溫度控制的需求。本實驗制作的PDMS基片厚度為7.5 mm，PDMS材料本身導熱性差，使得腔內(nèi)反應(yīng)溫度不受外界影響。腔內(nèi)的溫度變化主要通過玻璃與TEC熱交換實現(xiàn)。反應(yīng)腔的體積為20 μL，屬于大體系下的PCR反應(yīng)[20]。PCR實驗中，反應(yīng)溫度設(shè)置均低于水的沸點，腔內(nèi)水分快速蒸發(fā)滲透到外表面難以發(fā)生。

2.5實驗方法

血液按照裂解試劑盒（QIAamp DNA Micro Kit）說明書進行裂解，然后將裂解過的血溶液（20 μL）加載到微流控芯片上，啟動微全分析系統(tǒng)。手工提取核酸使用離心機按照試劑盒標準提取方法進行[27]。提取完成之后取約為2 μL DNA原液與20 μL PCR反應(yīng)試劑混合，注入到芯片的PCR反應(yīng)腔進行擴增檢測。無論是芯片上自動提取的核酸，還是手工提取的核酸，擴增檢測均使用同一條件。根據(jù)所選的基因片段設(shè)置反應(yīng)所需要的條件：預變性階段95 ℃保持160 s后直接進入循環(huán)擴增階段；95 ℃保持15 s，降溫至60 ℃保持40 s，然后在72 ℃保持60 s，執(zhí)行40次循環(huán)；設(shè)置熔解的升溫步長為1 ℃/s， 每個步長保持時間為5 s。儀器根據(jù)設(shè)置好的參數(shù)進行PCR擴增檢測，給出分析結(jié)果。

3結(jié)果與討論

3.1微流體驅(qū)動與控制分析

集成核酸提取的PCR芯片流體通道為200～500 μm之間，提取過程中微流體在不同尺度的微通道內(nèi)多次交替，要求流體的驅(qū)動力不同，因此，微流體的驅(qū)動和控制尤其顯得困難。這種流動特性的變化使得宏觀流體驅(qū)動與控制技術(shù)在微流體中的簡單移植往往不成功或者效果不好。本研究根據(jù)集成核酸提取的微流控芯片的驅(qū)動和控制要求，對于裂解液的廢液抽取，Buffer Aw1、Buffer Aw2的驅(qū)動均采用2 mL/min的速度控制。 對于洗脫液AE、PCR反應(yīng)試劑驅(qū)動，PCR反應(yīng)腔溶液的注入均采用1 mL/min的速度控制。氣體流量控制器根據(jù)不同時段、不同量的驅(qū)動，采用不同的驅(qū)動參數(shù)，實現(xiàn)可變的控制，滿足了實驗過程中的微流體運動的控制和驅(qū)動。

3.2核酸提取過程分析

芯片上核酸提取過程的原理如圖3所示。在實物圖中，C0是提取腔里的一部分，提取腔E底層為微通道連接，中間層是硅膠膜，上層是血液加載腔；V1～V8是微閥連接微泵的通道，+號表示往管道施加正壓；號是表示施加負壓，氣路處于抽取空氣狀態(tài)。芯片上的操作過程包括FPGA控制系統(tǒng)首先啟動1號和5號電磁閥，抽取裂解液中的廢液至廢液腔；其次啟動2號電磁閥，氣動驅(qū)動50 μL Buffer Aw1到吸附柱中，洗滌DNA中雜質(zhì)；30 s后啟動5號電磁閥抽取廢液；廢液排空后，啟動3號電磁閥，驅(qū)動50 μL Buffer Aw2到吸附柱中，再次洗滌DNA中雜質(zhì)；30 s后再次啟動5號電磁閥抽取廢液；待洗滌液除盡后，繼續(xù)抽吸吸附柱，直到吸附膜干燥后關(guān)閉；啟動4號電磁閥，加入10 μL AE到吸附柱中，洗脫DNA，打開7號電磁閥抽約2 μL至混合腔；啟動6號電磁閥，推入PCR反應(yīng)試劑20 μL到混合腔；最后啟動8號電磁閥，抽取混合腔溶液至PCR反應(yīng)腔，對PCR反應(yīng)腔兩端進行密封，即可開始PCR擴增與熔解檢測分析。

Fig.3Schematic diagrams of nucleic acid extraction提取腔中的硅膠膜具有在高鹽低pH條件下能吸附DNA，低鹽高pH條件下釋放DNA的特性。在提取過程中通過Buffer Aw1的沖洗作用去除硅膠膜上吸附的蛋白、脂質(zhì)等雜質(zhì)，以獲得高質(zhì)量基因組DNA；通過Buffer Aw2的沖洗作用去除殘留乙醇，避免影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（PCR或酶切）；通過洗脫液TE的作用將膜上結(jié)合的DNA洗脫至溶液中，同時利于基因組DNA 充分溶解。混合腔利用重力溶合PCR試劑和DNA溶液，經(jīng)過S通道又進一步混合[34]。整個DNA的提取到PCR反應(yīng)，過程操作快速、簡便。

3.3核酸的擴增檢測分析

對于提取的DNA通過PCR擴增進行檢測，首先加熱使DNA雙鏈在95℃解鏈變?yōu)閮蓷l單鏈，然后降溫至延伸階段，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則，DNA單鏈合成雙鏈，數(shù)量成倍增加，實現(xiàn)DNA的指數(shù)擴增。SYBR Green熒光染料能與DNA雙鏈結(jié)合，通過中心波長約為497 nm的LED激發(fā)光激發(fā)能夠發(fā)出波長約為520 nm的熒光[35]。在延伸期，利用CCD檢測熒光信號的強度，就能實現(xiàn)DNA序列擴增量的實時監(jiān)測。因此，在PCR擴增體系內(nèi)，熒光信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。本研究針對提取的DNA鏈上的GAPDH基因，自行設(shè)計引物，進行了PCR擴增與熔解曲線分析。通過分析GAPDH基因的檢測結(jié)果，可以對DNA提取效率以及提取質(zhì)量加以判別分析。

本研究對兩種提取方法進行了對比實驗。在圖4中曲線1、2為手工提取核酸的擴增曲線，曲線3、4為芯片上自動提取核酸的擴增曲線。從圖4A可見，手工提取與芯片法提取的DNA鏈上的GAPDH基因在PCR反應(yīng)后均獲得了明顯的擴增，手工提取法的Ct值（反應(yīng)腔內(nèi)熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）分別是22.5和23.0， 芯片法的Ct值分別為25.3和26.9，結(jié)果表明均實現(xiàn)了基因組DNA的提取與GAPDH基因的擴增檢測。從熔解曲線圖4B可見，均有統(tǒng)一的熔解溫度值89.9℃，表明了芯片法提取結(jié)果的準確性。由于手工提取與芯片自動提取使用的裂解液量與洗脫液量比例不同，提取的DNA濃度有差異，所以擴增曲線不完全重合。但是從熔解曲線可以看出，單一的熔解峰，相一致的熔解溫度值表明了擴增產(chǎn)物是來自基因組DNA的同一個基因片段，而且提取的基因組DNA純度高、質(zhì)量好。

4結(jié)論

本實驗成功研制了集成核酸提取的PCR芯片以及芯片的驅(qū)動控制、檢測、分析系統(tǒng)，并成功地從人體全血的裂解液中提取了基因組DNA，并進行了GAPDH基因的擴增與檢測，通過實驗對比驗證了系統(tǒng)的可行性與結(jié)果的正確性。芯片上核酸提取使用的試劑量幾乎是傳統(tǒng)法的1/10，而且全自動化、全封閉的操作，大大改善了傳統(tǒng)操作技術(shù)耗時長、試劑消耗量大、操作步驟繁瑣、操作過程易受污染等缺點。本研究使得集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統(tǒng)本身具有的快速、高靈敏度、低消耗、易于集成化、便攜化的獨特優(yōu)勢更好、更充分的發(fā)揮出來，提高了微流控芯片的自動化操作水平。

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