利用pET—20b克隆與表達多功能半纖維素酶

彭靜靜

摘要：將來源于嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus， JW200）的雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB） 構(gòu)建到pET-20b（+）上，得到質(zhì)粒pET-20b-xarB。將來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）構(gòu)建到pET-20b-xarB上，得到表達質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA。將重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）進行表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示，該重組酶的分子量為108 kDa，與理論值相符。

關(guān)鍵詞：阿拉伯/木糖苷酶；木聚糖酶；pET-20b（+）；多功能半纖維素酶；克?。槐磉_

中圖分類號：Q785 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4205-03

Cloning and Expression of a Trifunctional Hemicellulase Using pET-20b in Escherichia coli

PENG Jing-jing

（College of Biology and Enology， Taishan University， Taian 271021， Shandong， China）

Abstract： The structure gene from Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 encoding arabinosidase-xylosidase XarB gene was amplified and ligated into pET-20b（+）， resulting in pET-20b-xarB. The structure gene from Thermomyces lanuginosus DSM 5826 encoding xylanase（XynA） was amplified and ligated into pET-20b-xarB， resulting in pET-20b-xarB-xynA. The trifunctional enzyme （XarB-XynA） was obtained after expression pET-20b-xarB-xynA in Escherichia coli JM109（DE3）. SDS-PAGE analysis showed that the molecular mass of the expressed recombinant XarB-XynA was about 108 kDa， the same as the predicted size.

Key words： arabinosidase-xylosidase； xylanase； pET-20b（+）；XarB-XynA； cloning； expression

農(nóng)業(yè)廢棄物是指農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)副產(chǎn)品加工后的剩余物，主要包括農(nóng)作物或果樹的秸稈或枝條、果實外殼、玉米芯、甘蔗渣等，其主要化學(xué)成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，是亟待開發(fā)的重要可再生資源。我國每年秸稈產(chǎn)量達6億t左右，目前大部分秸稈用于燃燒或者被廢棄[1]。秸稈中半纖維素的含量占總干重的25%～50%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)較纖維素復(fù)雜，其徹底降解的產(chǎn)物主要是木糖和少量阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，可以用作基本碳源生產(chǎn)有機酸、氨基酸、單細胞蛋白、糖醇、工業(yè)酶類溶劑或燃劑。

來自嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus，JW200）的阿拉伯/木糖苷酶，以人工底物進行測試，其木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性分別為每毫克蛋白質(zhì)180和1 000 U，高于其他木糖苷酶或阿拉伯糖苷酶的活性[2]。疏棉狀嗜熱絲孢菌（T. lanuginosus DSM 5826）所產(chǎn)生的木聚糖酶A（XynA）屬于G/11家族，具有較好的熱穩(wěn)定性，在高溫和堿性條件下有效且穩(wěn)定，沒有纖維素活性，具有工業(yè)化應(yīng)用前景，且研究發(fā)現(xiàn)，該木聚糖酶優(yōu)先降解高聚合度的木聚糖鏈，產(chǎn)物是不同聚合度的低聚木糖，不產(chǎn)生木單糖，這對于生產(chǎn)低聚木糖具有很好的應(yīng)用價值[3]。同時使用多種克隆的特異水解某一多糖結(jié)構(gòu)的水解酶來降解木聚糖，清潔高效，但工序復(fù)雜，成本高。在不改變酶自身優(yōu)良性質(zhì)的條件下，如果將有關(guān)的水解酶融合串聯(lián)成一個具有多種水解酶活性的多功能酶，或通過融合標(biāo)簽回收重復(fù)利用酶，來提高融合酶的綜合效率，這將大大簡化工序并降低成本[4-6]。

本研究采用帶有T7強啟動子的pET系列表達載體，將嗜熱厭氧乙醇菌的雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）進行基因融合，得到多功能酶的融合表達質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA。通過蛋白質(zhì)工程構(gòu)建多功能半纖維素酶（XarB-XynA）來促進生物轉(zhuǎn)化，為酶法降解半纖維素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：E. coli DH10B、E. coli JM109（DE3）（購自Promega公司）。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基添加終濃度為2%的瓊脂粉。

含有雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的重組質(zhì)粒pHsh-xarB、含有疏棉狀嗜熱絲孢菌 （T. lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因的質(zhì)粒pHsh-xynA2由本實驗早期構(gòu)建并保存。質(zhì)粒pET-20b（+） （購自Novagen 公司）。endprint

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 DNA 操作采用分子克隆技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法進行。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化方法進行，質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物采用Qiagen plasmid kit 和PCR purification kit（Qiagen USA）進行純化。

1.2.2 基因克隆 根據(jù)GenBank中嗜熱厭氧乙醇菌（JW200）雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的基因序列（GenBank登錄號AF135015）設(shè)計引物xarB-N和xarB-C。xarB-N ： 5- CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGCCATTATATTTAGAT-3，下劃線為 XbaⅠ酶切位點。xarB-C：5- CCCGATATC TTTATTCTCTACCCTTACTTCC -3，下劃線為 EcoR V酶切位點。以提取的重組質(zhì)粒pHsh-xarB為模板， 利用相應(yīng)的上下游引物擴增雙活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB，為提高所擴增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對模板進行擴增。具體方法見參考文獻[2，3]。所得質(zhì)粒命名為pET-20b-xarB，雙酶切驗證正確的質(zhì)粒送上海美吉生物技術(shù)公司測序。

根據(jù)GenBank中疏棉狀嗜熱絲孢菌（DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因序列（GenBank 登錄號U35436）以及本試驗優(yōu)化的pHsh-XynA2的木聚糖酶A（XynA）基因序列，以重組質(zhì)粒pHsh-xynA2為模板，設(shè)計引物xynA-N和xynA-C。xynA-N： 5-CCCGATATCATGCAGACTACCCCGA-3，下劃線為EcoR V酶切位點。xynA-C：5-CCGCTCGAGGCCAACGTCAGCAACA-3，下劃線為為 XhoⅠ酶切位點。

以pHsh-xynA2為模板，利用相應(yīng)的上下游引物擴增基因xynA，為提高所擴增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對模板進行擴增。具體方法見參考文獻[2，3]。PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測正確后純化，將pET-20b-xarB質(zhì)粒和PCR擴增純化后的DNA片段分別用EcoR V和XhoⅠ雙酶切，割膠回收DNA片段和載體酶切產(chǎn)物，乙醇沉淀濃縮，16 ℃下連接6～12 h。連接液轉(zhuǎn)化至E.coli DH10B，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒用EcoR V和XhoⅠ內(nèi)切酶酶切驗證，得到重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA，雙酶切驗證正確的質(zhì)粒送上海美吉生物技術(shù)公司測序。

1.2.3 重組蛋白的表達與純化 重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA電轉(zhuǎn)化到宿主細胞E. coli JM109 （DE3）中，挑取重組單菌落接種于含100 μg/mL的氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至OD600 nm為0.6～0.8，加IPTG至濃度為0.8 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，離心收集菌體。用50 mmol/L pH為7.5的 Tris-HCl 緩沖液洗滌細胞2次，并用相同緩沖液重懸細胞，置于冰水浴中用超聲波破碎儀破碎細胞， 超聲條件為50 Hz×15 s×8， 細胞碎片于12 000 r/min 離心10 min，去除上清液即為粗酶液。將粗酶液在60 ℃熱處理30 min后，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min去除變性蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-20b-xarB的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中嗜熱厭氧乙醇菌（JW200）雙活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB的序列，以重組質(zhì)粒pHsh-xarB為模板，用引物xarB-N和xarB-C進行PCR擴增，結(jié)果如圖1A所示，擴增出來的片段與基因?qū)嶋H大小2 355 bp是相符的。

PCR產(chǎn)物驗證正確后過柱純化，并用XbaⅠ和EcoR V進行雙酶切，酶切后的pET-20b（+）質(zhì)粒進行連接，得到重組質(zhì)粒pET-20b-xarB。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR V單酶切后釋放出6 000 bp大小的條帶，經(jīng)XbaⅠ和EcoR V雙酶切后，釋放出2 300 bp大小的條帶，與基因大小一致，同時在3 700 bp處有一條帶和pET-20b（+）載體酶切后條帶大小一致，結(jié)果如圖1B所示，測序結(jié)果表明基因xarB序列與公布的序列完全一致。

2.2 重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pHsh-xynA2為模板，以xynA-N和xynA-C為引物進行PCR擴增，將純化后的DNA片段與pET-20b-xarB分別用EcoR V和XhoⅠ進行

雙酶切，連接后挑選陽性克隆，得到重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA。重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ單酶切后釋放出6 600 bp大小的條帶，經(jīng)XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切后，釋放出2 955 bp大小的條帶，與基因（xarB+xynA）大小一致，同時在3 700 bp處有一條帶和pET-20b（+）載體酶切后條帶大小一致，酶切結(jié)果如圖2所示。

2.3 重組多功能半纖維素酶的表達及檢測

將重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA電轉(zhuǎn)化到宿主細胞E. coli JM109（DE3）中，挑取重組單菌落接種于含100 g/mL 的氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8，加IPTG至濃度為0.8 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，離心收集菌體。以pET-20b（+）轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為對照，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，重組菌均能產(chǎn)生約108 kDa的特異條帶，結(jié)果如圖3所示，與預(yù)期的蛋白質(zhì)相對分子量大小一致。

3 討論

雖然已有多種木聚糖酶被提純或基因克隆，并且這些酶在底物特異性熱穩(wěn)定性及酶反應(yīng)的底物范圍等性能方面都各有優(yōu)勢，但是相對于半纖維素結(jié)構(gòu)及其降解的復(fù)雜特點，僅靠自然菌種所產(chǎn)酶的單一優(yōu)良性質(zhì)仍不能實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的高效利用，也不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。重組酶XarB這個雙重活性的酶可與木聚糖酶協(xié)同作用徹底降解阿拉伯木聚糖，是工業(yè)酶制劑的理想酶源，從而為構(gòu)建多功能半纖維素融合酶提供一個很好的酶材料。endprint

本研究將來源于嗜熱厭氧乙醇菌雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）同時構(gòu)建到pET-20b（+）上，得到融合酶表達質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大腸桿菌里面成功表達。雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的雜合酶在降解農(nóng)業(yè)廢棄物方面有著明顯的優(yōu)勢，將有助于提高農(nóng)業(yè)廢棄物的降解效率。

參考文獻：

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本研究將來源于嗜熱厭氧乙醇菌雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）同時構(gòu)建到pET-20b（+）上，得到融合酶表達質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大腸桿菌里面成功表達。雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的雜合酶在降解農(nóng)業(yè)廢棄物方面有著明顯的優(yōu)勢，將有助于提高農(nóng)業(yè)廢棄物的降解效率。

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本研究將來源于嗜熱厭氧乙醇菌雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）同時構(gòu)建到pET-20b（+）上，得到融合酶表達質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大腸桿菌里面成功表達。雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的雜合酶在降解農(nóng)業(yè)廢棄物方面有著明顯的優(yōu)勢，將有助于提高農(nóng)業(yè)廢棄物的降解效率。

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