葡萄霜霉病拮抗細(xì)菌N6的分離、篩選及鑒定

郭繼平+馬光+朱會(huì)霞+劉長(zhǎng)遠(yuǎn)+傅俊范

摘要：篩選葡萄霜霉病菌的拮抗菌株，為該病害的生物防治提供更多的資源。采用稀釋平板分離法，從3個(gè)品種的健康葡萄葉片上分離得到細(xì)菌153株。初篩采用平板對(duì)峙法，得到5株拮抗辣椒疫病菌的菌株。采用葉盤法進(jìn)行復(fù)篩，得到防治葡萄霜霉病效果好并且穩(wěn)定的菌株N6，其防效達(dá)到74.2%。通過對(duì)菌株N6的形態(tài)、生長(zhǎng)特性、生理生化反應(yīng)、16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌株為磚紅微桿菌（Microbacterium testaceum）。

關(guān)鍵詞：葡萄霜霉病菌菌株；拮抗細(xì)菌；分離；篩選；鑒定磚紅微桿菌（Microbacterium testaceum）

中圖分類號(hào)：S432.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）17-4063-03

Isolation， Screening and Identification of Antagonistic Bacteria Strain N6 Against Grape Downy Mildew

GUO Ji-ping1，2， MA Guang2， ZHU Hui-xia2， LIU Chang-yuan3， FU Jun-fan1

（1. College of Plant Protection， Shenyang Agricultural University， Shenyang，110161，China；

2. Department of Life Science， Hengshui University， Hengshui 053000， Hebei，China；

3. Institute of Plant Protection， Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161，China）

Abstract： The antagonistic bacteria against grape downy mildew were screened to provide more resources for biologically controlling of the disease. With streak plate method， 153 bacterial strains were isolated from the health grape leaves of three varieties. Screened by a dual culture technique， 5 strains exhibiting antagonistic activities against pepper phytophthora blight were obtained. Using the leaf disc for secondary screening， N6 was screened from the 5 strains. N6 had the better inhibitory effect， with biocontrol efficacy of 74.2%. The results showed the strain was identified as Microbacterium testaceum， through analyzing its morphological， physiological and biochemical characteristics， 16S rDNA sequence and phylogenetics.

Key words： grape downy mildew； antagonistic bacteria； isolation； screening； identification

葡萄霜霉病是一種世界性病害，病原為葡萄生單軸霉（Plasmopara viticala），屬鞭毛菌亞門卵菌綱霜霉菌目霜霉菌科單軸霉屬[1]。該病原是一種專性寄生真菌，菌絲體為無隔、多核菌絲，在寄主細(xì)胞間擴(kuò)展蔓延，以瘤狀吸器從寄主細(xì)胞內(nèi)吸取營(yíng)養(yǎng)。發(fā)病部位產(chǎn)生白色霉霜狀霉層，即病菌的孢子囊及孢子囊梗。葡萄霜霉病以卵孢子在病組織中或隨病葉在土壤中越冬，是病害的初侵染源[2]。

葡萄霜霉病目前的防治手段主要是使用抗性品種[3，4]、改進(jìn)生產(chǎn)管理技術(shù)和化學(xué)防治[5，6]。常年使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留等問題。隨著綠色農(nóng)業(yè)的蓬勃發(fā)展，利用生物防治植物病害越來越受關(guān)注。如利用枯草芽孢桿菌B-FS01對(duì)葡萄霜霉病進(jìn)行防治，防效達(dá)88.25%，但該菌劑還未實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)[7]。陳嬌等[8]測(cè)定了58種植物提取液對(duì)葡萄霜霉病菌的抑菌效果，結(jié)果表明，虎耳草、黃檀、馬尾松、牡丹、刺槐5種植物提取液對(duì)葡萄霜霉病有抑菌效果。本研究篩選出了有效防治葡萄霜霉病的拮抗細(xì)菌N6，并對(duì)此菌種進(jìn)行鑒定，為生防菌的儲(chǔ)備和進(jìn)一步的應(yīng)用開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticala）取自衡水市葡萄采摘園。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[9]；生理生化鑒定培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[10]。

1.3 葡萄葉片采集與細(xì)菌分離

選擇3個(gè)葡萄品種（巨峰、紅乳和夏黑），分別在開花期、坐果期、硬核期和轉(zhuǎn)色期進(jìn)行采樣，每個(gè)葡萄品種設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)取4片葉，用滅菌紙袋帶回實(shí)驗(yàn)室對(duì)其表面細(xì)菌進(jìn)行分離。在無菌條件下將葉片剪碎后放入盛有50 mL無菌水的三角瓶中，加2～3滴吐溫80，在150 r/min的振蕩器上振蕩30 min，菌懸液用無菌水稀釋。在培養(yǎng)皿中加入0.1 mL稀釋液，然后將熔化后冷卻至45 ℃的NA培養(yǎng)基倒入并混勻[11]，28 ℃培養(yǎng)3 d，把形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行純化并保存。。

1.4 拮抗細(xì)菌的篩選

1.4.1 拮抗細(xì)菌的初篩 初篩采用平板對(duì)峙法，挑取辣椒疫病菌菌餅（直徑5 mm）置于PDA平板一側(cè)，待測(cè)菌用接種環(huán)點(diǎn)種于距離病原菌菌落約1.5 cm處。28 ℃下培養(yǎng)3～5 d后觀測(cè)并記錄抑菌圈情況，同時(shí)保存拮抗性強(qiáng)的菌種。

1.4.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩 采集已感染葡萄霜霉病菌并發(fā)病的葡萄葉片和新梢第四至六輪沒有發(fā)病的葉片（品種為巨峰），將其裝進(jìn)無菌紙袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。用毛刷將采集的發(fā)病葉片背面的白色霉層刷掉，活體培養(yǎng)24 h，等白色的霉?fàn)钗镉种匦麻L(zhǎng)出后，用軟毛刷輕輕的刷取霉?fàn)钗?，置于無菌水中，形成懸浮液（孢子囊1×106個(gè)/mL）。沒有發(fā)病的葉片在其葉脈間用打孔器制成直徑1 cm的葉盤，將葉盤分別放在不同拮抗菌液（菌體含量1×107個(gè)/mL）中浸泡1 min，晾干浮水后，葉片的背面朝上擺放于潤(rùn)濕的吸水紙上，將葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液用小噴壺均勻噴施到葉盤上。每培養(yǎng)皿中放15個(gè)葉盤，每個(gè)處理重復(fù)3次。放在光暗交替（光照︰黑暗=12 h∶12 h）、22 ℃條件下培養(yǎng)7 d后觀察結(jié)果，計(jì)算病情指數(shù)。葡萄霜霉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[1]。為了驗(yàn)證拮抗菌的穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳代5次，采用葉盤法復(fù)篩，觀察其抑菌效果的穩(wěn)定性。

1.5 拮抗細(xì)菌的鑒定

拮抗細(xì)菌N6的形態(tài)特征及生理生化特征測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]和文獻(xiàn)[10]中的方法進(jìn)行。分子鑒定中，拮抗細(xì)菌N6總DNA的提取采用北京三博遠(yuǎn)志SG051離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA。擴(kuò)增引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min、 55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)測(cè)序得到N6菌株的16S rDNA基因序列，選擇數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI）對(duì)其進(jìn)行比較分析，通過Blast比對(duì)找到同源序列并對(duì)比對(duì)區(qū)域進(jìn)行打分以確定同源性的高低，通過軟件CLUSTAL和MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄葉片上附生細(xì)菌的分離

根據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤與生長(zhǎng)速度等特征，從3個(gè)葡萄品種葉片上分離到的附生細(xì)菌，鑒定得到菌株153株。

2.2 拮抗細(xì)菌的篩選

2.2.1 初篩結(jié)果 采用對(duì)峙培養(yǎng)法初篩，選出5株對(duì)辣椒疫病菌有明顯拮抗作用的附生細(xì)菌（表1），占所有分離附生細(xì)菌總數(shù)的3.3%，分別是Y2、Y13、Y87、N6、N41。N6菌株的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為22.1 mm。對(duì)照菌落長(zhǎng)勢(shì)正常，在PDA培養(yǎng)基上為圓形，處理菌落不規(guī)則，且與拮抗細(xì)菌接觸的部分生長(zhǎng)緩慢。

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果 將初篩得到的5株細(xì)菌進(jìn)行了復(fù)篩，結(jié)果見表2。由表2可知， N6菌株的防治效果最好，防效達(dá)74.2%，其他菌株的防效在36.4%～62.3%之間。菌株N6葉盤復(fù)篩情況見圖1，由圖1可知， 對(duì)照葉盤有明顯的白色霉層，而N6霉層的面積明顯減少，N6菌株經(jīng)傳代5次，抑菌效果穩(wěn)定。

2.3 拮抗菌株N6的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征

拮抗細(xì)菌N6菌體為短小桿狀，菌落呈圓形、凸起，邊緣整齊，淺乳桔色，略有光澤，不透明，不產(chǎn)生芽孢。

2.3.2 生理生化特征 該菌株最適生長(zhǎng)溫度28 ℃，革蘭氏反應(yīng)呈陽(yáng)性，好氧菌。能利用蔗糖、甘露醇、木糖、果糖、葡萄糖和麥芽糖，不能利用甘油、核糖、乳糖、硝酸鹽和檸檬酸鹽。接觸酶陽(yáng)性，明膠液化、H2S試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均是陰性。

2.3.3 16S rDNA 序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株N6的總DNA用通用引物擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度大約1.8 kb（圖2），經(jīng)測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)，菌株N6的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 440 bp。

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)將N6菌株的16S rDNA序列與其相關(guān)的種屬進(jìn)行比對(duì)，選出15個(gè)與菌株N6同源性高的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由圖3可見，菌株N6與Microbacterium testaceum（磚紅微桿菌）聚為一支，親緣關(guān)系最近。

通過菌株N6的形態(tài)學(xué)特征、生長(zhǎng)特性、生理特征和生化特征、16S rDNA序列的比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合文獻(xiàn)[10]，將N6菌株最終鑒定為磚紅微桿菌（M. testaceum）。

3 討論

目前用于葡萄霜霉病的生防資源較少，被報(bào)道的僅有枯草芽孢桿菌和龜裂鏈霉菌[7]，所以本研究為葡萄霜霉病生防資源的儲(chǔ)備提供了一株優(yōu)良菌種。本研究所得菌株的有效活性抑菌成分分離、鑒定及其抑菌機(jī)理均有待進(jìn)一步研究，期望研制出在葡萄霜霉病生物防治中具有應(yīng)用前景的生物農(nóng)藥。

參考文獻(xiàn)

[1] 陸家云.植物病原真菌學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[2] BURRUANO S. The life cycle of Plasmopara viticola， cause of downy mildew of vine[J]. Mycological， 2000， 14（4）： 179-182.

[3] 李 華，沙海江.葡萄優(yōu)質(zhì)抗病新品種‘88-01的選育[A].中國(guó)科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)第二屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)園藝學(xué)論文集[C].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995.

[4] 李 華，張振文，王 華，等.葡萄優(yōu)質(zhì)抗病新品系的研究[A].國(guó)際葡萄與葡萄酒學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].西安：陜西人民出版社，1998.

[5] 劉會(huì)寧.葡萄霜霉病及其綜合防治[J].北方園藝，1999（4）：42-43.

[6] 王小芹，張今今，劉 蕾.葡萄霜霉病的綜合防治[J].西北園藝， 2002（3）：44.

[7] 陳 浩，胡梁斌，唐春平，等.枯草芽胞桿菌B-FS01對(duì)葡萄霜霉病的防治效果[J].植物保護(hù)，2011，37（6）：194-197.

[8] 陳 嬌，代光輝，顧振芳，等.58種植物提取液對(duì)葡萄霜霉病菌的抑菌活性篩選研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14（5）：9-13.

[9] 沈 萍，范秀容，李光武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第三版.北京：高等教育出版社，2000.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[11] 于淑池，徐亞茹.拮抗細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)及拮抗機(jī)理研究進(jìn)展[J].承德職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006（1）：67-69.

1.4 拮抗細(xì)菌的篩選

1.4.1 拮抗細(xì)菌的初篩 初篩采用平板對(duì)峙法，挑取辣椒疫病菌菌餅（直徑5 mm）置于PDA平板一側(cè)，待測(cè)菌用接種環(huán)點(diǎn)種于距離病原菌菌落約1.5 cm處。28 ℃下培養(yǎng)3～5 d后觀測(cè)并記錄抑菌圈情況，同時(shí)保存拮抗性強(qiáng)的菌種。

1.4.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩 采集已感染葡萄霜霉病菌并發(fā)病的葡萄葉片和新梢第四至六輪沒有發(fā)病的葉片（品種為巨峰），將其裝進(jìn)無菌紙袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。用毛刷將采集的發(fā)病葉片背面的白色霉層刷掉，活體培養(yǎng)24 h，等白色的霉?fàn)钗镉种匦麻L(zhǎng)出后，用軟毛刷輕輕的刷取霉?fàn)钗?，置于無菌水中，形成懸浮液（孢子囊1×106個(gè)/mL）。沒有發(fā)病的葉片在其葉脈間用打孔器制成直徑1 cm的葉盤，將葉盤分別放在不同拮抗菌液（菌體含量1×107個(gè)/mL）中浸泡1 min，晾干浮水后，葉片的背面朝上擺放于潤(rùn)濕的吸水紙上，將葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液用小噴壺均勻噴施到葉盤上。每培養(yǎng)皿中放15個(gè)葉盤，每個(gè)處理重復(fù)3次。放在光暗交替（光照︰黑暗=12 h∶12 h）、22 ℃條件下培養(yǎng)7 d后觀察結(jié)果，計(jì)算病情指數(shù)。葡萄霜霉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[1]。為了驗(yàn)證拮抗菌的穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳代5次，采用葉盤法復(fù)篩，觀察其抑菌效果的穩(wěn)定性。

1.5 拮抗細(xì)菌的鑒定

拮抗細(xì)菌N6的形態(tài)特征及生理生化特征測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]和文獻(xiàn)[10]中的方法進(jìn)行。分子鑒定中，拮抗細(xì)菌N6總DNA的提取采用北京三博遠(yuǎn)志SG051離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA。擴(kuò)增引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min、 55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)測(cè)序得到N6菌株的16S rDNA基因序列，選擇數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI）對(duì)其進(jìn)行比較分析，通過Blast比對(duì)找到同源序列并對(duì)比對(duì)區(qū)域進(jìn)行打分以確定同源性的高低，通過軟件CLUSTAL和MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄葉片上附生細(xì)菌的分離

根據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤與生長(zhǎng)速度等特征，從3個(gè)葡萄品種葉片上分離到的附生細(xì)菌，鑒定得到菌株153株。

2.2 拮抗細(xì)菌的篩選

2.2.1 初篩結(jié)果 采用對(duì)峙培養(yǎng)法初篩，選出5株對(duì)辣椒疫病菌有明顯拮抗作用的附生細(xì)菌（表1），占所有分離附生細(xì)菌總數(shù)的3.3%，分別是Y2、Y13、Y87、N6、N41。N6菌株的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為22.1 mm。對(duì)照菌落長(zhǎng)勢(shì)正常，在PDA培養(yǎng)基上為圓形，處理菌落不規(guī)則，且與拮抗細(xì)菌接觸的部分生長(zhǎng)緩慢。

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果 將初篩得到的5株細(xì)菌進(jìn)行了復(fù)篩，結(jié)果見表2。由表2可知， N6菌株的防治效果最好，防效達(dá)74.2%，其他菌株的防效在36.4%～62.3%之間。菌株N6葉盤復(fù)篩情況見圖1，由圖1可知， 對(duì)照葉盤有明顯的白色霉層，而N6霉層的面積明顯減少，N6菌株經(jīng)傳代5次，抑菌效果穩(wěn)定。

2.3 拮抗菌株N6的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征

拮抗細(xì)菌N6菌體為短小桿狀，菌落呈圓形、凸起，邊緣整齊，淺乳桔色，略有光澤，不透明，不產(chǎn)生芽孢。

2.3.2 生理生化特征 該菌株最適生長(zhǎng)溫度28 ℃，革蘭氏反應(yīng)呈陽(yáng)性，好氧菌。能利用蔗糖、甘露醇、木糖、果糖、葡萄糖和麥芽糖，不能利用甘油、核糖、乳糖、硝酸鹽和檸檬酸鹽。接觸酶陽(yáng)性，明膠液化、H2S試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均是陰性。

2.3.3 16S rDNA 序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株N6的總DNA用通用引物擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度大約1.8 kb（圖2），經(jīng)測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)，菌株N6的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 440 bp。

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)將N6菌株的16S rDNA序列與其相關(guān)的種屬進(jìn)行比對(duì)，選出15個(gè)與菌株N6同源性高的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由圖3可見，菌株N6與Microbacterium testaceum（磚紅微桿菌）聚為一支，親緣關(guān)系最近。

通過菌株N6的形態(tài)學(xué)特征、生長(zhǎng)特性、生理特征和生化特征、16S rDNA序列的比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合文獻(xiàn)[10]，將N6菌株最終鑒定為磚紅微桿菌（M. testaceum）。

3 討論

目前用于葡萄霜霉病的生防資源較少，被報(bào)道的僅有枯草芽孢桿菌和龜裂鏈霉菌[7]，所以本研究為葡萄霜霉病生防資源的儲(chǔ)備提供了一株優(yōu)良菌種。本研究所得菌株的有效活性抑菌成分分離、鑒定及其抑菌機(jī)理均有待進(jìn)一步研究，期望研制出在葡萄霜霉病生物防治中具有應(yīng)用前景的生物農(nóng)藥。

參考文獻(xiàn)

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[2] BURRUANO S. The life cycle of Plasmopara viticola， cause of downy mildew of vine[J]. Mycological， 2000， 14（4）： 179-182.

[3] 李 華，沙海江.葡萄優(yōu)質(zhì)抗病新品種‘88-01的選育[A].中國(guó)科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)第二屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)園藝學(xué)論文集[C].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995.

[4] 李 華，張振文，王 華，等.葡萄優(yōu)質(zhì)抗病新品系的研究[A].國(guó)際葡萄與葡萄酒學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].西安：陜西人民出版社，1998.

[5] 劉會(huì)寧.葡萄霜霉病及其綜合防治[J].北方園藝，1999（4）：42-43.

[6] 王小芹，張今今，劉 蕾.葡萄霜霉病的綜合防治[J].西北園藝， 2002（3）：44.

[7] 陳 浩，胡梁斌，唐春平，等.枯草芽胞桿菌B-FS01對(duì)葡萄霜霉病的防治效果[J].植物保護(hù)，2011，37（6）：194-197.

[8] 陳 嬌，代光輝，顧振芳，等.58種植物提取液對(duì)葡萄霜霉病菌的抑菌活性篩選研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14（5）：9-13.

[9] 沈 萍，范秀容，李光武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第三版.北京：高等教育出版社，2000.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[11] 于淑池，徐亞茹.拮抗細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)及拮抗機(jī)理研究進(jìn)展[J].承德職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006（1）：67-69.

1.4 拮抗細(xì)菌的篩選

1.4.1 拮抗細(xì)菌的初篩 初篩采用平板對(duì)峙法，挑取辣椒疫病菌菌餅（直徑5 mm）置于PDA平板一側(cè)，待測(cè)菌用接種環(huán)點(diǎn)種于距離病原菌菌落約1.5 cm處。28 ℃下培養(yǎng)3～5 d后觀測(cè)并記錄抑菌圈情況，同時(shí)保存拮抗性強(qiáng)的菌種。

1.4.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩 采集已感染葡萄霜霉病菌并發(fā)病的葡萄葉片和新梢第四至六輪沒有發(fā)病的葉片（品種為巨峰），將其裝進(jìn)無菌紙袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。用毛刷將采集的發(fā)病葉片背面的白色霉層刷掉，活體培養(yǎng)24 h，等白色的霉?fàn)钗镉种匦麻L(zhǎng)出后，用軟毛刷輕輕的刷取霉?fàn)钗?，置于無菌水中，形成懸浮液（孢子囊1×106個(gè)/mL）。沒有發(fā)病的葉片在其葉脈間用打孔器制成直徑1 cm的葉盤，將葉盤分別放在不同拮抗菌液（菌體含量1×107個(gè)/mL）中浸泡1 min，晾干浮水后，葉片的背面朝上擺放于潤(rùn)濕的吸水紙上，將葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液用小噴壺均勻噴施到葉盤上。每培養(yǎng)皿中放15個(gè)葉盤，每個(gè)處理重復(fù)3次。放在光暗交替（光照︰黑暗=12 h∶12 h）、22 ℃條件下培養(yǎng)7 d后觀察結(jié)果，計(jì)算病情指數(shù)。葡萄霜霉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[1]。為了驗(yàn)證拮抗菌的穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳代5次，采用葉盤法復(fù)篩，觀察其抑菌效果的穩(wěn)定性。

1.5 拮抗細(xì)菌的鑒定

拮抗細(xì)菌N6的形態(tài)特征及生理生化特征測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]和文獻(xiàn)[10]中的方法進(jìn)行。分子鑒定中，拮抗細(xì)菌N6總DNA的提取采用北京三博遠(yuǎn)志SG051離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA。擴(kuò)增引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min、 55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)測(cè)序得到N6菌株的16S rDNA基因序列，選擇數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI）對(duì)其進(jìn)行比較分析，通過Blast比對(duì)找到同源序列并對(duì)比對(duì)區(qū)域進(jìn)行打分以確定同源性的高低，通過軟件CLUSTAL和MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄葉片上附生細(xì)菌的分離

根據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤與生長(zhǎng)速度等特征，從3個(gè)葡萄品種葉片上分離到的附生細(xì)菌，鑒定得到菌株153株。

2.2 拮抗細(xì)菌的篩選

2.2.1 初篩結(jié)果 采用對(duì)峙培養(yǎng)法初篩，選出5株對(duì)辣椒疫病菌有明顯拮抗作用的附生細(xì)菌（表1），占所有分離附生細(xì)菌總數(shù)的3.3%，分別是Y2、Y13、Y87、N6、N41。N6菌株的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為22.1 mm。對(duì)照菌落長(zhǎng)勢(shì)正常，在PDA培養(yǎng)基上為圓形，處理菌落不規(guī)則，且與拮抗細(xì)菌接觸的部分生長(zhǎng)緩慢。

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果 將初篩得到的5株細(xì)菌進(jìn)行了復(fù)篩，結(jié)果見表2。由表2可知， N6菌株的防治效果最好，防效達(dá)74.2%，其他菌株的防效在36.4%～62.3%之間。菌株N6葉盤復(fù)篩情況見圖1，由圖1可知， 對(duì)照葉盤有明顯的白色霉層，而N6霉層的面積明顯減少，N6菌株經(jīng)傳代5次，抑菌效果穩(wěn)定。

2.3 拮抗菌株N6的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征

拮抗細(xì)菌N6菌體為短小桿狀，菌落呈圓形、凸起，邊緣整齊，淺乳桔色，略有光澤，不透明，不產(chǎn)生芽孢。

2.3.2 生理生化特征 該菌株最適生長(zhǎng)溫度28 ℃，革蘭氏反應(yīng)呈陽(yáng)性，好氧菌。能利用蔗糖、甘露醇、木糖、果糖、葡萄糖和麥芽糖，不能利用甘油、核糖、乳糖、硝酸鹽和檸檬酸鹽。接觸酶陽(yáng)性，明膠液化、H2S試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均是陰性。

2.3.3 16S rDNA 序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株N6的總DNA用通用引物擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度大約1.8 kb（圖2），經(jīng)測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)，菌株N6的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 440 bp。

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)將N6菌株的16S rDNA序列與其相關(guān)的種屬進(jìn)行比對(duì)，選出15個(gè)與菌株N6同源性高的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由圖3可見，菌株N6與Microbacterium testaceum（磚紅微桿菌）聚為一支，親緣關(guān)系最近。

通過菌株N6的形態(tài)學(xué)特征、生長(zhǎng)特性、生理特征和生化特征、16S rDNA序列的比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合文獻(xiàn)[10]，將N6菌株最終鑒定為磚紅微桿菌（M. testaceum）。

3 討論

目前用于葡萄霜霉病的生防資源較少，被報(bào)道的僅有枯草芽孢桿菌和龜裂鏈霉菌[7]，所以本研究為葡萄霜霉病生防資源的儲(chǔ)備提供了一株優(yōu)良菌種。本研究所得菌株的有效活性抑菌成分分離、鑒定及其抑菌機(jī)理均有待進(jìn)一步研究，期望研制出在葡萄霜霉病生物防治中具有應(yīng)用前景的生物農(nóng)藥。

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