廢棄煙沫堆置發(fā)酵有機(jī)肥腐熟菌種的分離、篩選和鑒定

王明旭 江維維 劉艷霞 遲蓀琳 石俊雄 李想

摘要 [目的]為加速煙草廢棄物的資源化利用，篩選適合廢棄煙沫快速發(fā)酵腐熟的微生物菌種成為資源化利用的重要一環(huán)。[方法]利用纖維素剛果紅選擇性培養(yǎng)基，分別從廢棄煙絲、腐熟牛糞、油枯有機(jī)肥和味精下腳料等田固體廢棄物中分離篩選腐熟菌種，并進(jìn)行復(fù)篩、純化和鑒定。[結(jié)果]共篩得16株腐熟菌株，其中復(fù)篩出6株高效菌株分別為F1、F2、F3、N1、N2、W1。經(jīng)16S rDNA和Biolog鑒定，該6種菌菌株分別為Bacillus subtillis，Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus amyloliquefaciens，Mycobacterium vaccae，Bacillis amyloliquefaciens;纖維素分解能力試驗(yàn)結(jié)果表明，6種降解菌對(duì)煙沫中纖維素的降解能力為N1>F3>N2>F2>F1>W1;在煙堿濃度為低濃度0.1%時(shí)耐煙堿能力為F2>F3=N1>W1>F1>N2，在煙堿濃度為高濃度0.5%時(shí)耐煙堿能力為F2>F3>N1>N2>W1=F1，同時(shí)N1與N2、N1與F1、N1與F2之間沒(méi)有拮抗作用。[結(jié)論]N1與N2復(fù)配構(gòu)成廢棄煙沫專用腐熟菌種為最佳選擇。

關(guān)鍵詞 煙沫廢棄物;腐熟菌種;纖維素降解菌;煙堿;16S rDNA;Biolog

中圖分類號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11686-05

Isolation， Screening and Identification of Decompositing Microorganisms for Tobacco Scrap Solid-state Fermentation

WANG Ming-xu1， JIANG Wei-wei1， LIU Yan-xia2， LI Xiang2* et al

（1. Renhuai Tobacco Filiale， Renhuai， Guizhou 564500; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang， Guizhou 550081）

Abstract [Objective]In order to accelerate the decomposition of solid organic wastes of tobacco， the screening of composting microorganism plays a key role in tobacco scrap rapid process fermentation. [Method]Decomposing strains from tobacco crap， dairy manure， rapeseed meal and monosodium glutamate waste samples were screened， purified and identified by Congo red screening medium in this experiment. [Result]Six dominant strains of sixteen strains，named as F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，N1，N2 and W1 were isolated and identified as Bacillus subtillis，Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus amyloliquefaciens，Stenotrophomonas maltophilia，Bacillis amyloliquefaciens by 16S rDNA sequence homologies and Biolog Identification. The results showed that the ability of cellulose decomposition of strains were N1>F3>N2>F2>F1>W1. Besides， the tolerances to 0.1% nicotine of 6 strains were F2>F3=N1>W1>F1>N2， while to 0.5 % nicotine were F2>F3>N1>N2>W1=F1. There was no antagonistic effect between N1 and N2， N1 and F1， and N1 and F2. [Conclusion] The combination of N1 and N2 was considered as the best complex decompositing strains for tobacco srap solid-state fermentation.

Key words Tobacco scrap; Decomposing microorganisms; Cellulose decomposition strain; Nicotine; 16S rDNA; Biolog

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金《貴州省青枯病導(dǎo)病與抑病型土壤微生物網(wǎng)絡(luò)差異研究》項(xiàng)目（41461068）;公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)201103004;貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目黔科合J字[2013]2197、2198;中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目《酒糟快速腐熟生產(chǎn)有機(jī)肥技術(shù)研究及在烤煙生產(chǎn)上的應(yīng)用》（201410）。

作者簡(jiǎn)介 王明旭（1970- ），男，貴州綏陽(yáng)人，助理農(nóng)藝師，從事煙草生產(chǎn)與管理方面的研究。*通訊作者，助理研究員，博士，從事植物營(yíng)養(yǎng)與土壤微生物等方面的研究。

收稿日期 2014-10-20

我國(guó)煙草的種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，目前國(guó)內(nèi)外煙草主要用作卷煙。作為煙草生產(chǎn)大國(guó)，我國(guó)煙草種植面積約130萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量450萬(wàn)～500萬(wàn)t。在卷煙加工生產(chǎn)中會(huì)產(chǎn)生大量的煙葉、煙沫等下腳料廢棄物。我國(guó)煙草廢棄物的年總量在90萬(wàn)～100萬(wàn)t，約占總產(chǎn)量的25%[1]，其中大部分被廢棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。

煙沫廢棄物指除去具有烘烤價(jià)值葉片以外的煙草莖株部分，包括煙莖、煙根、土腳葉、“優(yōu)化結(jié)構(gòu)”政策優(yōu)化掉的葉片、煙花、煙種、腋芽[2]。煙草體內(nèi)已檢測(cè)出的化學(xué)物超過(guò)1 000多類，主要包括各種烴、芳香烴、醛、酮、甾醇、醇、醌、酯、生物堿、色素、類異戊二烯衍生物、氨基酸和蛋白類等十幾大類物質(zhì)[3]。經(jīng)進(jìn)一步細(xì)分，鑒定出包括植物堿、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、淀粉、甘油三脂、糖類、單寧、果膠、纖維素等3 000多種化合物，其中多數(shù)化合物是光合作用的產(chǎn)物，具有很高的使用價(jià)值[4]。

對(duì)廢棄煙葉的綜合利用，一直受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視。有很多的研究報(bào)道，如從廢棄煙葉中提取煙堿，生產(chǎn)煙堿農(nóng)藥，提取茄尼醇用于生產(chǎn)輔酶Q10等藥物[5];從未成熟的鮮煙葉中提取類似大豆蛋白質(zhì)的煙草蛋白質(zhì)，作為優(yōu)質(zhì)飼料的添加劑[6]等。但是，尚有大量的煙草廢棄物未得到很好的利用。煙草廢棄物中有很強(qiáng)植物毒性的煙堿存在，所以雖然含有豐富的有機(jī)質(zhì)，但不能作為有機(jī)肥直接施于土壤，而單獨(dú)堆肥腐熟耗時(shí)較長(zhǎng)，煙堿降解效果差，且會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，而且可能導(dǎo)致滋生病蟲害的傳播。目前國(guó)內(nèi)常通過(guò)添加大量的植物秸稈于煙草廢棄物中，以稀釋降解不徹底的煙堿對(duì)農(nóng)作物帶來(lái)的負(fù)面影響，使煙草廢棄物成為很好的有機(jī)肥源[7]。

高附加值的農(nóng)業(yè)廢棄物的肥料化利用，特別是高附加值的生物有機(jī)肥及有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合肥的開(kāi)發(fā)，不但能解決環(huán)境污染問(wèn)題，而且可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供大量的有機(jī)肥料。這是減少農(nóng)業(yè)面源污染、節(jié)約資源發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)的重要途徑[8]。在農(nóng)業(yè)廢棄物高附加值肥料利用過(guò)程中，加快升溫速度、縮短堆腐時(shí)間是有機(jī)肥生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵，而接種菌劑是加快堆肥升溫、促進(jìn)發(fā)酵腐熟過(guò)程的措施[9-10]。竹江良等[11]研究了配備不同比例豬糞對(duì)煙草廢棄物高溫堆肥腐熟進(jìn)程的影響，發(fā)現(xiàn)在煙草廢棄物中加入豬糞能縮短進(jìn)入高溫分解階段的時(shí)間，延長(zhǎng)高溫分解持續(xù)時(shí)間，增加全氮含量，加快物料NH2-N轉(zhuǎn)化和C/N 比降低的速率，縮短堆肥腐熟時(shí)間。該課題主要是篩選出能夠使煙沫廢棄物高效腐熟的微生物菌種，使得煙沫廢棄物能夠資源化利用，不僅能夠解決烤煙區(qū)的環(huán)境問(wèn)題，而且能夠?yàn)闊熮r(nóng)帶來(lái)更多的收入。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1

分離樣品。堆肥后期（10 d）的廢棄煙沫、牛糞有機(jī)肥、油枯有機(jī)肥、味精下腳料等樣品用于腐熟菌種的分離、篩選，并用篩選到的菌種驗(yàn)證纖維素降解能力。

1.1.2

培養(yǎng)基及配方。纖維素降解菌富集培養(yǎng)基：NaNO3 0.5 g，KCl 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 痕量，MgSO4·7H2O 0.5 g，濾紙條，蒸餾水1 000 ml。濾紙條用濃度1%稀醋酸浸泡24 h，再用濃度2%蘇打水沖洗至中性，滅菌后備用。

纖維素降解菌篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g，KH2PO4 1.0 g，尿素 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5 mg，MnSO4·H2O 2.5 mg，ZnSO4·7H2O 3.6 mg，CoCl2·6H2O 3.7 mg，CaCl2 0.5 g，0.02%剛果紅，16 g瓊脂，去離子水定容至1 L。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，固體加瓊脂 16 g，用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200 g，蔗糖（或葡萄糖） 20 g，固體加瓊脂16 g，用于真菌的分離、培養(yǎng)。

高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20.0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，固體加瓊脂16 g，用于放線菌的分離、培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

纖維素降解菌的分離與篩選。

1.2.1.1

富集。稱取10 g混合均勻的樣品，加入90 ml無(wú)菌水中，振蕩，制成懸濁液，靜置約5 min后取上清液2 ml到5 ml滅菌的富集培養(yǎng)基中，將處理過(guò)的濾紙條放入富集培養(yǎng)基中，并將試管置于搖床中，170 r/min，37 ℃培養(yǎng)，待濾紙崩解后取2 ml轉(zhuǎn)接至新鮮的富集培養(yǎng)基內(nèi)，連續(xù)富集3次。

1.2.1.2

初篩。吸取連續(xù)富集3次的富集液0.5 ml，梯度稀釋后，選擇10-4、10-5和10-6 3個(gè)梯度，分別吸取0.1 ml涂布于篩選培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯菌落后用1 mol/L NaCl倒入培養(yǎng)基中處理10～15 min，選擇有透明圈的菌株，將細(xì)菌轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，放線菌轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，并且劃線純化，鏡檢沒(méi)有雜菌后，用濃度15%甘油-20 ℃保存。將長(zhǎng)出的真菌菌落在PDA培養(yǎng)基上單孢分離純化3次后，制備真菌孢子懸液后，同樣用濃度15%甘油-20 ℃保存。

1.2.1.3

復(fù)篩。將4 ℃保存的菌體接種到篩選培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h后測(cè)定菌落與透明圈的大小。

1.2.2

細(xì)菌的鑒定。

1.2.2.1

分子生物學(xué)鑒定。將純菌落接種到4.5 ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，170 r/min，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，12 000×g離心30 s后收集菌體，進(jìn)行基因組DNA的提取?；蚪MDNA的提取使用Axygen菌體DNA提取試劑盒完成，具體步驟參照說(shuō)明書。

細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增以具體各自的基因組DNA為模板，使用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。

16S rRNA基因擴(kuò)增的引物為27F和1541R。 PCR反應(yīng)體系：

Premix TaqVersion 2.0 25 μl，

模板DNA 1 μl，

引物1 1 μl，

引物2 1 μl，

dH2O 22 μl。

PCR反應(yīng)條件：

95 ℃， 5 min;

95 ℃， 30 s;

58 ℃， 30 s 32周期;

72 ℃， 1 min;

72 ℃， 10 min;

4 ℃， ∞。

1.2.2.2

Biolog鑒定。將獲得的純培養(yǎng)菌種劃線接種至羊血培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌種12～16 h;用Inoculatorz棉簽從瓊脂平板中有細(xì)胞生長(zhǎng)的地方沾取直徑3 mm的菌落接種于接種液A中調(diào)好濁度;將菌懸液倒入V型加樣水槽中，使用8道移液槍將接種液接于GenⅢ板上;將GenⅢ板放于Biolog系統(tǒng)中，30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3

細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。取純化3～5代后的菌種，活化在平板上后接入30 ml液體培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h，作為種子液;以1%的接種量接入裝有200 ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，在微生物搖床中30 ℃、170 r/min培養(yǎng)48～72 h，每隔2 h取樣1次，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm的條件下測(cè)量吸光度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線[13]。

1.2.4

菌種分解纖維素能力大小的測(cè)定。將純化的菌種點(diǎn)接到以纖維素為唯一碳源的剛果紅篩選培養(yǎng)基中央，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，用1 mol/L NaCl處理，測(cè)量透明圈的大小。

1.2.5

菌種的耐煙堿程度檢驗(yàn)。根據(jù)廢棄煙沫中的煙堿含量，設(shè)置煙堿濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將不同濃度梯度煙堿加入裝有30 ml培養(yǎng)基的100 ml三角瓶中。將待測(cè)菌種的種子液以1%的接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后用紫外分光光度計(jì)以波長(zhǎng)600 nm測(cè)量OD值。細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌用高氏一號(hào)培養(yǎng)基。

1.2.6

菌種的復(fù)配試驗(yàn)。

1.2.6.1

復(fù)配菌株之間拮抗作用測(cè)試。將纖維素降解能力較強(qiáng)的6個(gè)菌株分別編號(hào)為F1、F2、F3、N1、N2、W1。在測(cè)定菌株F1對(duì)其他5個(gè)菌株是否具有拮抗作用時(shí)，將菌株F1點(diǎn)接到固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中央，在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后，分別用猴頭瓶均勻噴灑其他5個(gè)菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，然后于30 ℃微生物培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，觀察是否有拮抗圈，并且測(cè)量其大小。以此類推，分別測(cè)定菌株F2、F3、N1、N2、W1對(duì)其他菌株是否具有拮抗作用。

1.2.6.2

復(fù)配菌株耐煙堿能力測(cè)試。將沒(méi)有拮抗作用2個(gè)菌株的種子液等量加入配置好的煙堿濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，用分光光度計(jì)，以波長(zhǎng)600 nm測(cè)量吸光度，測(cè)定無(wú)拮抗作用的復(fù)配菌株對(duì)煙堿的耐性濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離、篩選和鑒定

2.1.1

纖維素降解菌的分離、篩選。以纖維素為唯一碳氮源，經(jīng)過(guò)初篩和純化，從發(fā)酵后的廢棄煙沫中得到3株菌株F1、F2和F3;從牛糞肥料中得到2株菌株N1和N2;從味精下腳料中得到1株菌株W1，共6個(gè)純的細(xì)菌菌株，確定為試驗(yàn)菌株。表1為篩選菌株的培養(yǎng)特性。菌株的菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。

表1 菌株的培養(yǎng)特征

2.1.2

菌種鑒定。由表2可知，菌株F1為

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis），菌株F3為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株N1為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株W1同樣為

解淀粉芽孢桿菌（Bacillis amyloliquefaciens）。菌株F2和N2的2種鑒定方法的結(jié)果不同。這是由于2種鑒定方法的原理不同，用16S rDNA和特征性C源測(cè)序各有優(yōu)缺點(diǎn)[14]。經(jīng)過(guò)中國(guó)微生物研究所鑒定，菌株F2為枯草芽孢桿菌，菌株N2為母牛分枝桿菌（Mycobacterium vaccae）。

2.2 菌株生長(zhǎng)曲線

以菌株液體培養(yǎng)的時(shí)間為橫坐標(biāo)，以各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得菌液的平均OD600值為縱坐標(biāo)，繪制出各菌株的生長(zhǎng)曲線。所有篩選到的菌種在適宜的條件下培養(yǎng)經(jīng)歷了延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個(gè)階段。從圖2可以

圖1 菌株的菌落形態(tài)

表2 菌株的16S rDNA 和Biolog 鑒定結(jié)果

看出，0～4 h為F1和F3的延遲期，0～2 h為F2、N1、N2、W1的延遲期，菌種適應(yīng)新的環(huán)境，繁殖的速度很慢;5～28 h為F1和F3的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3～24 h為F2的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3～10 h為N1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3～14 h為N2的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3～22 h為W1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很充分，細(xì)菌呈對(duì)數(shù)快速增長(zhǎng);對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后為穩(wěn)定期，由于培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷地被消耗掉，細(xì)菌新陳代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的積累及pH下降等因素的影響，細(xì)菌繁殖的速度逐漸下降，而死亡的細(xì)菌數(shù)開(kāi)始逐漸增加，增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平衡，細(xì)菌總數(shù)處于穩(wěn)定的狀態(tài);當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，而毒性物質(zhì)越來(lái)越多，細(xì)菌的繁殖速度逐漸減緩，死亡菌數(shù)明顯增多，衰亡的速度超過(guò)繁殖的速度，細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，進(jìn)入衰亡期。

2.3 菌株纖維素分解能力

剛果紅瓊脂培養(yǎng)基是較好的分離篩選培養(yǎng)基。纖維素降解菌能夠在紅色平板上形成透明圈（圖3），且透明圈/菌落直徑比值大致反映其降解纖維素能力[15]。從表3可以看出，將菌株按降解纖維素能力強(qiáng)弱順序排列為N1>F3>N2> F2>F1>W1。

2.4 菌株耐煙堿能力測(cè)試

從表4可以看出，在煙堿濃度為0.1%時(shí)，菌株F2的煙堿耐性在0.05水平顯著高于其他5種菌株，耐性最高，菌株F3與N1的煙堿耐性無(wú)顯著差異，菌株N2的煙堿耐性最低;在煙堿濃度為0.2%時(shí)，菌株F3的煙堿耐性最高，菌株F1的煙堿耐性最低;在煙堿濃度為0.3%時(shí)，菌株F3的煙堿耐性最高，菌株F2和N1的煙堿耐性無(wú)顯著差異，菌株W1的煙堿耐性最低;在煙堿濃度為0.4%時(shí)，菌株N2的煙堿耐性最高，W1的煙堿耐性最低;在煙堿濃度為0.5%時(shí)，菌種F2的煙堿耐性最高，菌種F1和W1的煙堿耐性無(wú)顯著性差異，為最低。由此可知，菌株F2、F3和N2的煙堿耐性較好。

2.5 菌種組配試驗(yàn)

2.5.1

菌株之間的拮抗分析。從表5可以看出，N1與N2、N1與F1、N1與F2之間沒(méi)有拮抗作用，可以進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。

圖2 菌株的生長(zhǎng)曲線

圖3 菌株F3降解纖維素透明圈

表3 菌株大小及透明圈

2.5.2

復(fù)配菌株的耐煙堿能力研究。從表6可以看出，將N1和N2進(jìn)行復(fù)配后的煙堿耐性要在0.05水平顯著高于N1和N2純菌株的煙堿耐性。在煙堿濃度為0.5%時(shí)，N1+N2在0.05水平顯著高于N1，是N1煙堿耐性的4.34倍，同時(shí)在0.05水平顯著高于N2，為N2的8.67倍。

表4 菌株的煙堿耐性

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

表5 菌株間的拮抗作用

注：“-”表示菌株間無(wú)拮抗作用;“+”表示菌株間有拮抗作用。

從表7可以看出，只有在煙堿濃度為0.2%和0.4%時(shí)，菌株復(fù)配后N1+F2的煙堿耐性在0.05水平顯著高于N1和F2純菌株的煙堿耐性;在煙堿濃度為0.1%時(shí)，復(fù)配菌株N1+F2的煙堿耐性為最低，僅為F2的92.3%。

從表8可以看出，菌株N1和F1復(fù)配后的煙堿耐性在各煙堿濃度上均在0.05水平顯著高于菌株N1和F1的煙堿耐性。

表6 復(fù)配菌株N1、N2與純菌株耐煙堿能力比較

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

表7 復(fù)配菌株N1， F2與純菌株耐煙堿能力比較

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

表8 復(fù)配菌株N1， F1與純菌株耐煙堿能力比較

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

從表9可以看出，在3種復(fù)配組合中，N1和N2菌株的復(fù)配后耐煙堿的效果在各煙堿濃度上均在0.05水平顯著高于N1+F2，在煙堿0.2%濃度上與N1+F1處理之間無(wú)差異，超過(guò)煙堿0.3%濃度后，N1+F2處理耐煙堿能力在0.05水平顯著高于N1+F1，分別是其1.15倍（0.3%）、1.99倍（0.4%）和1.58倍（0.5%）。

表9 三種復(fù)配菌株耐煙堿能力比較

注：同列不同小寫字母表示差異在0.05水平顯著。

3 結(jié)論與討論

腐熟的作物秸稈含有大量有機(jī)質(zhì)和煙草生長(zhǎng)發(fā)育所必須的多種營(yíng)養(yǎng)元素，可以增加土壤中腐殖質(zhì)含量，改善土壤理化性質(zhì)，增強(qiáng)地力，涵養(yǎng)水分，對(duì)促進(jìn)煙株健壯生長(zhǎng)、提高煙葉產(chǎn)質(zhì)量都有積極作用[16]。近年來(lái)，對(duì)于作物秸稈降解菌的研究越來(lái)越受到關(guān)注[17]，但由于煙稈和煙葉具有煙堿的特殊性，煙沫廢棄物的纖維降解菌不但具有較好的降解纖維素的能力，而且需要對(duì)煙堿有一定的耐性。該研究從廢棄煙絲、腐熟牛糞、油枯有機(jī)肥、味精下腳料中分離并篩選出Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Mycobacterium vaccae等6株對(duì)纖維素具有降解能力且不同程度耐鹽堿的細(xì)菌。綜合6株細(xì)菌分解煙沫纖維素能力和耐煙堿能力，最終確定適宜的煙沫廢棄物堆置發(fā)酵腐熟菌種。然而，由于單一菌種的功能性有限，采用復(fù)配菌種更能達(dá)到預(yù)期效果[18]。Lwin等[19]分別用離體和活體2種方法驗(yàn)證了混合光合細(xì)菌對(duì)茄科勞爾氏菌的拮抗作用，發(fā)現(xiàn)這些有效的混合微生物不但可以通過(guò)增加植物光合和固氮作用提高作物產(chǎn)量，而且可以防控土傳病害，加快降解土壤中的木質(zhì)素。該試驗(yàn)綜合菌株的各項(xiàng)綜合能力，最終確定彼此

無(wú)拮抗作用的N1與N2復(fù)配構(gòu)建煙沫專用腐熟菌種。該研究結(jié)果對(duì)解決當(dāng)前有效利用烤煙廢棄秸稈、煙葉及肥力轉(zhuǎn)化有一定的實(shí)際意義。

竹江良等[11]研究認(rèn)為，在煙草廢棄物高溫堆肥過(guò)程中，在添加合適豬糞比例的基礎(chǔ)上加入外源微生物菌劑（NNY、FB），有利于堆體迅速進(jìn)入高溫分解階段，延長(zhǎng)高溫分解持續(xù)時(shí)間，縮短發(fā)酵堆肥時(shí)間，顯著增加腐熟后堆肥產(chǎn)品的總孔隙度和持水孔隙度，提高堆肥產(chǎn)品品質(zhì)。吉增福等[20]對(duì)秸稈的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化做了詳盡的研究，發(fā)現(xiàn)纖維分解菌用于對(duì)玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化，能使?fàn)I養(yǎng)水平低的秸稈的營(yíng)養(yǎng)成分得到明顯改善。其中，粗蛋白由5.22%提高到24.62%，粗脂肪由0.67%提高到12.52%，成為可替代15%～20%的混合日糧用于豬的飼料。在發(fā)酵過(guò)程中，一方面煙沫廢棄物為菌種提供生存和繁育的營(yíng)養(yǎng)，另一方面菌種加速物料中各種物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，使廢棄物盡快“變廢為寶”。

該試驗(yàn)篩選出的菌株N1和N2的纖維素降解能力較強(qiáng)，但其耐鹽堿能力相比F3和F2較弱。這可能是由于菌株F2、F3從發(fā)酵煙絲中篩選出來(lái)的，其生存過(guò)程中已經(jīng)適應(yīng)較高濃度煙堿的環(huán)境，因此具有較強(qiáng)的耐鹽堿。應(yīng)用微生物處理烤煙廢棄物作為一種安全、無(wú)污染環(huán)保形式，可以縮短烤煙廢棄物的發(fā)酵時(shí)間，減少?gòu)U棄物中有害成分（包括煙堿、蛋白質(zhì)、果膠以及煙草特有的亞硝胺（TSNA）等）。將經(jīng)過(guò)微生物處理的烤煙廢棄物置于土壤中，有利于土壤結(jié)構(gòu)的改良和養(yǎng)分的補(bǔ)充。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物將具有更大的應(yīng)用潛力。如何更加有效利用篩選出的6種菌株，并將其實(shí)際應(yīng)用到田間有待進(jìn)一步研究。

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