安徽道地藥材斷血流的愈傷組織誘導條件研究

陳宇 王芳 李耀亭

摘要 [目的]研究不同基礎培養(yǎng)基及添加的植物生長調節(jié)劑濃度對斷血流愈傷組織的誘導效果。[方法]通過配制不同的培養(yǎng)基，選擇適宜誘導斷血流愈傷組織的培養(yǎng)基;然后選用適宜的培養(yǎng)基，研究不同濃度的6-BA及NAA對斷血流愈傷組織誘導的影響。[結果]MS、N6、B5、RM、Miller 5種基本培養(yǎng)基中，適合斷血流愈傷組織誘導的基本培養(yǎng)基為MS;研究不同的生長素NAA及細胞分裂素6-BA濃度時發(fā)現，NAA為0.1 mg/L和6-BA為1.0 mg/L時，斷血流組培效果較好。[結論]斷血流組培效果最好的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基中NAA為0.1 mg/L和6-BA為1.0 mg/L。

關鍵詞 斷血流;培養(yǎng)基;植物生長調節(jié)劑;誘導;愈傷組織

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11667-02

Research on the Condition of Calls Induction of Genuine Clinopodii polycephali of Anhui

CHEN Yu1， WANG Fang1， LI Yao-ting2*

（1. Xishan Biotechnology Company Ltd of Luan， Luan， Anhui 237005; 2.Plant Cell Engineering of West Anhui University Engineering Research Center of Anhui， Luan， Anhui 237012）

Abstract [Objective] The research aimed to study the effect of the media types and the concentration of plant growth regulator on the callus induction of Clinopodii polycephali. [Method] Choose the suitable culture medium from the preparation of different kinds of medium. In the appropriate culture medium cases， the effect of the different concentration of 6-BA and NAA on inducing callus of Clinopodii polycephali were studied.[Result]MS was best to induce callus of Clinopodii polycephali among MS， N6， B5， RM， Miller.The research of the different concentrations of auxin NAA and cytokinin 6-BA found that when NAA was 0.1 mg/L and 6-BA was 1.0 mg/L， the effect on inducing callus of Clinopodii polycephali was better. [Conclusion]The best suitable medium was MS with NAA 0.1 mg/L and 6-BA 1.0 mg/L.

Key words Clinopodii polycephali;Medium; Plant growth regulator; Induction; Callus

基金項目 安徽省科技攻關計劃項目（12010402083）。

作者簡介 陳宇（1988- ），女，山東棗莊人，碩士，從事中藥材病蟲害防治研究。*通訊作者，工程師，博士，從事中藥材組培及栽培技術研究。

收稿日期 2014-10-15

斷血流是1970年從安徽民間發(fā)掘出來的止血藥，為皖西大別山道地中藥，是唇形科植物風輪菜Clinopodium chinensis或蔭風輪Clinopodium polycephalum的干燥地上部分;風輪菜載于1406年的《救荒本草》，蔭風輪載于1848年的《植物明實圖考》。風輪菜分布于浙江、江西、福建、廣東、廣西、貴州等地;蔭風輪主要分布于江蘇、安徽、廣西、貴州、云南、四川等地。皖西大別山斷血流年產量300 t左右，藥材微苦、味澀、辛涼，其功能為涼血止血。2005版藥典一部收載的斷血流即為上述2種原植物。臨床上應用于吐血、咯血、尿血、崩漏、外傷出血等[1-4]，用處較廣，市場潛力良好。筆者通過試驗研究不同的基礎培養(yǎng)基以及添加的植物生長調節(jié)劑濃度對斷血流愈傷組織的誘導效果，為進一步的誘導育種和斷血流皂苷A的工業(yè)化生物合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

六安霍山采集的斷血流。

1.2 培養(yǎng)條件

在無菌室內進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在（25±2）℃，光照強度 1 800～2 000 lx，每天光照 12 h。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同基本培養(yǎng)基對斷血流愈傷組織誘導的影響。

1.3.1.1 培養(yǎng)基的配制。

以MS、N6、B5、RM、Miller為基本的培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L、細胞分裂素6-BA（1.0 mg/L）和生長素NAA（0.1 mg/L）。將做好的培養(yǎng)基攪拌均勻，并用氫氧化鈉將pH調整至5.8～6.0。

1.3.1.2 培養(yǎng)基的滅菌。將配制好的培養(yǎng)基分裝到組培瓶中，用蓋子封好，分裝，封口、 標明培養(yǎng)基種類和日期，放入高壓滅菌鍋滅菌。

1.3.1.3 接種外植體。接種前，將斷血流幼嫩的莖尖先用洗衣粉水溶液浸泡5～10 min，再用自來水沖洗30 min。將試驗要用到的解剖刀、剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿等先放入超凈工作臺上，打開紫外燈照射 20 min。20 min 后攜帶外植體進入無菌室，用75%的乙醇擦拭超凈工作臺面、雙手及接種工具。金屬接種工具每次使用前均要在酒精燈上灼燒滅菌。先用 75%的乙醇對嫩葉進行表面消毒，再用0.1% 的 HgCl2滅菌 5～8 min，用無菌水沖洗5次，在滅菌過程中要不斷搖晃試管，使其充分滅菌。如此重復進行 3 次滅菌，將已滅菌的斷血流幼嫩的莖尖，在無菌條件下切成5 mm×5 mm大小的方塊。分別接種到5種培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種5瓶，每種培養(yǎng)基重復3次。

1.3.2 不同濃度的6-BA及NAA對斷血流愈傷組織誘導的影響。

1.3.2.1 培養(yǎng)基的配制。

以MS為基本的培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L、細胞分裂素6-BA和生長素NAA。將做好的培養(yǎng)基按照一定梯度加入激素攪拌均勻（表1），并用氫氧化鈉將pH調整至5.8～6.0。分裝，封口、標明濃度和日期。

1.3.2.2 培養(yǎng)基的滅菌。滅菌方法同“1.3.1.2”項的方法。

表1 以MS為基本培養(yǎng)基的不同激素濃度的培養(yǎng)基

1.3.2.3 接種外植體。

接種前的準備工作同“1.3.1.3”項，在超凈工作臺上，每個濃度的培養(yǎng)基接種 5 瓶，每瓶接種5個嫩莖小塊，接種后標明接種時間。每個濃度重復3次。

2 結果與分析

2.1 5種基本培養(yǎng)基對斷血流愈傷組織誘導的影響

從接種3周后不同基本培養(yǎng)基對斷血流愈傷組織誘導的影響（表2）可以看出，MS培養(yǎng)基中原球莖出現率顯著高于N6和B5培養(yǎng)基等，MS、N6、B5、RM培養(yǎng)基均能夠誘導斷血流原球莖外植體，但Miller基本培養(yǎng)基不能誘導斷血流外植體的出現。由此可見，適合斷血流愈傷組織誘導的基本培養(yǎng)基為MS。

表2 5種基本培養(yǎng)基對斷血流愈傷組織誘導的影響

2.2 不同濃度的6-BA及NAA對斷血流愈傷組織誘導的影響

從接種3周后不同濃度的6-BA及NAA對斷血流原球莖形成的結果（表3）可以看出，不同濃度的6-BA及NAA對斷血流形成原球莖的效果不同，培養(yǎng)基（1）和（2）上培養(yǎng)出的原球莖健壯度較好，且原球率的出現率較高，但比較而言培養(yǎng)基（1）誘導效果顯著好于培養(yǎng)基（2）;培養(yǎng)基（3）和（4）上培養(yǎng)出原球莖數量少，且健壯度差。

表3 6 種不同濃度培養(yǎng)基對斷血流愈傷組織誘導的影響

3 結論

斷血流的組織培養(yǎng)研究在我國目前沒有報道。該試驗在總結前人研究成果[5-6]的基礎上，研究了不同基本培養(yǎng)基和不同濃度的激素對斷血流組培的影響。試驗結果表明，培養(yǎng)基（1）即MS培養(yǎng)基中NAA 0.1 mg/L、6-BA 1.0 mg/L，在斷血流組培中作用最好。

該組培最好的培養(yǎng)基誘導愈傷組織原球莖出現率為52%，較低，是生長素濃度的影響還是其他因素的影響，還需要進一步的研究。

參考文獻

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