植物組織總RNA提取方法的比較

楊曉娜

【摘 要】本文綜述了植物組織總RNA提取方法比較與難點對策分析。植物組織總RNA提取方法有化學試劑提取和試劑盒提取兩種?；瘜W試劑提取法有強變性劑法、CTAB法、熱硼酸法及改良熱硼酸法、LiCl-尿素法、陰離子去污劑法、皂土法、硅藻土-苯酚法。其中，除皂土法和硅藻土-苯酚法是近年提出的較新的植物組織總RNA提取方法外，其余的都被廣泛應(yīng)用。本文可為植物組織總RNA提取方法研究提供參考。

【關(guān)鍵詞】植物組織;總RNA提取;方法

RNA是轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達與調(diào)控機制的載體，是基因操作的重要對象。它主要包括3種：rRNA占82%，tRNA占16%，mRNA占2%[1]。RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解，而且植物組織RNA的提取較動物和微生物困難，如酚類物質(zhì)氧化后可使RNA 活性喪失[2]，多糖可形成難溶膠狀物質(zhì)與RNA一起被沉淀[3]，所以細胞內(nèi)RNA分子的多樣性和易被降解決定了其提取過程的復雜性。

所有RNA的提取過程都包括以下5個要點：即樣品細胞或組織的徹底破碎;有效地使核蛋白復合體變性;對內(nèi)源RNase的有效抑制;充分地將RNA從DNA和蛋白質(zhì)混合物中分離;對于多糖含量高的樣品還需要將多糖雜質(zhì)完全除去。其中最關(guān)鍵的是抑制RNase活性[4]。由于RNA的提取對分子生物學的研究至關(guān)重要，所以純度高、濃度高、完整性好的RNA為基因的下游操作例如：Northern雜交、mRNA純化、互補DNA文庫的構(gòu)建及PT-PCR等提供了良好的保證[5]。

但是，有關(guān)植物總RNA提取方法與難點對策分析的總結(jié)迄今仍不完整。2005年谷守芹等討論了植物組織總RNA提取的常用方法及檢測技術(shù)[6]。2009年楊占軍等簡要介紹了幾種植物組織總RNA的提取方法，總結(jié)了在提取過程中遇到的酚類物質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)的干擾及外源RNase污染等問題[7]。

本文較系統(tǒng)總結(jié)了近年有關(guān)植物組織總RNA提取的方法、適用范圍及提取過程中出現(xiàn)的問題和具體的解決策略，以期為總RNA提取方法的比較研究提供參考。

1 植物組織總RNA提取的方法

1.1 化學試劑提取

1.1.1 強變性劑法

1968年，Cox首次運用胍鹽從富含RNase的植物材料中抽提出無降解的RNA[8]。胍鹽和異硫氰酸胍都是強的蛋白質(zhì)變性劑，可以很快的抑制RNase而保證分離出完整的RNA[9]。其原理是高濃度的強變性劑鹽胍和異硫氰酸胍，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細胞結(jié)構(gòu)，使得核酸和核蛋白分離，滅活RNase，當細胞裂解后，除RNA外，還有DNA、蛋白質(zhì)和細胞碎片，可通過酚、氯仿等有機溶劑處理得到純化、完整的總RNA[10]。該方法的優(yōu)點在于有強烈的蛋白變性劑，能有效抑制植物材料及提取液中的RNase活性，可用于提取大量植物材料的RNA[7]。其缺點是有毒，價格偏高。適用于植物各類組織總RNA的提取。

1987年，CHOMCZYNSLI和LOGEMANN分別用異硫氰酸胍和鹽胍從植物組織中提取RNA[11-12]。2009年，萬群等用該法提取甘薯莖總RNA，所提取的RNA經(jīng)過甲醛凝膠電泳和紫外線分光光度計分析，RNA的質(zhì)量較高，基本沒有降解[13]。

1.1.2 CTAB法

1992年CHANG，PURYEAR和CAIRNEY運用CTAB法從松樹中分離出RNA[14]。該法的原理是較高濃度的CTAB不僅對植物細胞有較好的裂解作用，而且還能有效分離核蛋白與核酸的復合物，同時和巰基乙醇共同作用使蛋白變性、抑制RNase活性，使用無水乙醇或異丙醇沉淀總核酸，然后再選擇性地分離出RNA[6]。2005年，程水源等采用CTAB法提取銀杏葉的RNA，結(jié)果表明抽提的RNA經(jīng)電泳檢測，可見28 S rRNA 和18 S rRNA兩條主帶，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA經(jīng)RAPD擴增，出現(xiàn)清晰的條帶[15]。2008年，鄭楊等運用CTAB法從中國櫻桃花粉中快速提取RNA[16]。

1.1.3 熱硼酸法[17]及改良熱硼酸法[18]

該技術(shù)將硼酸緩沖體系、蛋白酶K消化蛋白和氯化鋰選擇性沉淀RNA等步驟偶聯(lián)在一起。硼酸可與酚類化合物依靠氫鍵形成復合物、二硫蘇糖醇作為還原劑，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可與多酚化合物形成復合體，這幾種物質(zhì)都可抑制植物組織中酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合[19]。因此，該技術(shù)非常適合于富含酚類物質(zhì)的植物組織中總RNA的提取。2004年，李繼剛和郭三堆研究和探討了一種可用于高質(zhì)量棉花總RNA提取的熱硼酸法，結(jié)果表明，該方法制備的RNA質(zhì)量較高[20]。

1.1.4 LiCl-尿素法

用高濃度尿素抑制RNase并分離核蛋白與核酸，用LiCl選擇性沉淀RNA。該方法操作簡單，試劑價格低廉，但有時會存在DNA污染。2002年，趙雙宜首次運用該法高質(zhì)量提取小麥幼葉和不同法發(fā)育時期種子的RNA[21]。2005年，趙小蘭等運用該法提取多花薔薇扦插苗根、葉總的RNA[22]。

1.1.5 陰離子去污劑法

陰離子去污劑可以解離核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合，并且蛋白質(zhì)與帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，在高鹽存在下形成SDS-蛋白質(zhì)復合物而沉淀[23]。去污劑多用SDS，主要作用是分離核蛋白與核酸復合物，并與巰基乙醇、苯酚等共同抑制RNase的活性。2008年，楊成君等運用SDS法提取紅果葉片的RNA，凝膠電泳顯示28S條帶是18S條帶亮度兩倍，而且無污染[24]。

1.1.6 皂土法

皂士具有吸附蛋白質(zhì)及有效抑制RNAse的特性[25-27]。其原理是在提取緩沖液中加入皂土，減少了后期酚/氯仿抽提的次數(shù)，從而降低了RNA的損耗，縮短了實驗時間，并且還能有效的抑制RNase。其特點是耗時少，提出的RNA樣品純度高，完整性好。2006年張容等以麻風樹幼葉為材料，在提取緩沖液中加入皂土有效地去除了蛋白質(zhì)并抑制RNAse，建立了一種高效的植物RNA提取方法[28]。