噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究進(jìn)展

賈圓圓 馮建軍 關(guān)瑞章

摘要 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是將目的基因克隆到噬菌體的外殼蛋白基因組中，轉(zhuǎn)染宿主菌后，使目的基因編碼蛋白和外殼蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)，呈現(xiàn)在噬菌體表面，通過(guò)一系列的篩選獲得特異性噬菌體抗體分子。介紹了噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的疾病防控、水環(huán)境監(jiān)測(cè)、水產(chǎn)品安全控制以及與抗體芯片結(jié)合研究等方面的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 噬菌體抗體庫(kù);水產(chǎn)養(yǎng)殖;研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào) S941 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11740-03

Research Progress of Phage Antibody Library Technology in Aquaculture

JIA Yuan-yuan， FENG Jian-jun*， GUAN Rui-zhang

（Eel Modern Industry Technology Engineering Research Center of Ministry Education， Key Lab of East China Sea Water Healthy Aquaculture of Ministry of Agriculture， Fishery College， Jimei University， Xiamen， Fujian 361061）

Abstract Target gene are displayed on the surface of filamentous bacteriophage by genetic fusion to a coat protein of phage is the basic principle of phage antibody library technology. The most characteristic of it is a direct physical link from genotype to phenotype and the specific antibody of the Phage could be obtained by screening of enrichment. In this paper， recent research progress on disease control， water environment monitoring， aquatic products safety control， and combination with the antibody microarray in the aquaculture industry has been reviewed.

Key words Phage antibody library; Aquaculture; Research progress

基金項(xiàng)目 福建省海洋與漁業(yè)廳項(xiàng)目（201212140006）;福建省教育廳項(xiàng)目（JA11150）;集美大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目（2010A001）。

作者簡(jiǎn)介 賈圓圓（1990- ），女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：魚(yú)類(lèi)疾病防控。

*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事魚(yú)類(lèi)疾病防控研究。

收稿日期 2014-10-11

抗體庫(kù)（Antibody library）技術(shù)主要是通過(guò)PCR技術(shù)克隆全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，重組、構(gòu)建到特定的表達(dá)載體中，在原核或真核生物體內(nèi)表達(dá)出具有生物學(xué)功能的抗體分子，并通過(guò)親和篩選獲得特異性抗體[1]。噬菌體抗體庫(kù)（Phage antibody library）技術(shù)是迄今為止發(fā)展最成熟、應(yīng)用最廣泛的制備抗體的技術(shù)，它是一種將PCR技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合，并在噬菌體表面表達(dá)、分泌，經(jīng)過(guò)篩選后獲得特異性抗體的技術(shù)[2]。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本原理是將外源DNA片段插入噬菌體編碼蛋白基因中，使外源DNA片段的表達(dá)產(chǎn)物與噬菌體的外殼蛋白融合，展示于噬菌體表面[3]，具有操作簡(jiǎn)單、低成本以及技術(shù)成熟等特點(diǎn)，在商業(yè)生產(chǎn)中被成功應(yīng)用[4]。目前，噬菌體抗體庫(kù)分為Fv、Fab、單鏈抗體（Single-chain antibody fragment）、單區(qū)抗體（Single domain antibody）和雙鏈抗體（Diabody）等類(lèi)型。單鏈抗體主要通過(guò)15個(gè)氨基酸序列（Gly4Ser）3 linker將重鏈和輕鏈連接起來(lái)，具有體積小、免疫原性低的特點(diǎn)，不易引起人體或動(dòng)物排斥反應(yīng)。因其無(wú)抗體Fc段，不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合，由于片段分子量較低，能夠有效穿透致密的組織屏障達(dá)到病灶部位，在醫(yī)療診斷和疾病治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，成為現(xiàn)代生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，被認(rèn)為是21世紀(jì)的陽(yáng)光產(chǎn)業(yè)[5-7]。

近年來(lái)，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)已逐步應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，在養(yǎng)殖病害防治、藥物殘留檢測(cè)、水體水質(zhì)監(jiān)測(cè)以及食品安全控制等方面已經(jīng)有不少報(bào)道。另外，也有學(xué)者將抗體庫(kù)技術(shù)與抗體芯片結(jié)合對(duì)多種水體病原菌進(jìn)行高通量檢測(cè)，為抗體庫(kù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。

1 噬菌體抗體庫(kù)在水產(chǎn)病害防控中的研究

1.1 細(xì)菌性疾病的防治

我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，水產(chǎn)品年總量約占世界總量的70%。由于環(huán)境的污染及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)本身的高密度、集約化生產(chǎn)，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害時(shí)有發(fā)生，每年造成近百億元的經(jīng)濟(jì)損失，其中細(xì)菌性疾病造成的危害和損失尤為嚴(yán)重[8]。

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種食源性的病源微生物，廣泛存在于浮游生物及海產(chǎn)品中，不僅能夠引發(fā)海產(chǎn)品的敗血癥，還會(huì)導(dǎo)致人的食物性中毒，引起惡心、嘔吐和腹瀉等腸胃炎疾病[9]。目前對(duì)于副溶血弧菌的致病機(jī)理尚不清楚，缺乏有效的預(yù)防與治療手段。三型分泌系統(tǒng)（T3SS）是已知副溶血弧菌致病的主要因子之一[10]，而T3SS毒力因子的運(yùn)輸管道Needle在其致病過(guò)程中起著決定性作用[11]。方遂等[12]通過(guò)Overlap-PCR將VH、Linker和VL組裝成完整的scFv基因，同時(shí)將scFv基因克隆到噬菌體載體pCANTAB-5E上，成功構(gòu)建了噬菌體單鏈抗體文庫(kù)，測(cè)得該文庫(kù)庫(kù)容量約為1.4×107 cfu/ml。經(jīng)過(guò)富集、淘洗得到2株驗(yàn)證無(wú)誤的單鏈抗體，經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)2株菌株可視為1株單鏈抗體，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明所篩選的單鏈抗體具有較高的抗體特異性。由于副溶血弧菌具有多個(gè)治病因子，將篩選到的單鏈抗體與副溶血弧菌的其他致病因子抗體結(jié)合，可制備多功能抗體，控制和治療副溶血弧菌的發(fā)生和擴(kuò)散。

鰻弧菌（Vibrio anguillarum）是海水魚(yú)及淡水魚(yú)中的重要致病菌，可以感染虹鱒、鰻鱺、鱸魚(yú)、黃魚(yú)、石斑魚(yú)等幾十種魚(yú)類(lèi)，致死率較高，在我國(guó)十分流行。夏永娟等[13]成功構(gòu)建了抗鰻弧菌獨(dú)特型單克隆抗體dsFv基因，并使其準(zhǔn)確的在M13噬菌體表面獲得了呈現(xiàn)。通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗鰻弧菌獨(dú)特型dsFv噬菌體能夠與抗原特異性結(jié)合，抗獨(dú)特型抗體能夠模擬抗原表位，可以作為疫苗使用[14-15]，而抗鰻弧菌獨(dú)特型dsFv噬菌體可以通過(guò)細(xì)菌繁殖大量獲得，降低了疫苗的成本。該dsFv噬菌體有望成為用于預(yù)防魚(yú)類(lèi)鰻弧菌感染的新一代基因工程疫苗。

1.2 病毒性疾病的防治

草魚(yú)呼腸孤病毒（Reovirus of grass carp，GCRV）是我國(guó)分離的第1株魚(yú)類(lèi)病毒[16-17]，是引起我國(guó)草魚(yú)幼魚(yú)出血病大面積暴發(fā)的主要病原體，這種疾病一旦爆發(fā)，其死亡率可高達(dá)85%[18]。陳叢琳等[19]從已構(gòu)建的小鼠天然噬菌體展示抗體文庫(kù)中淘選并獲得了可以特異性識(shí)別草魚(yú)IgM的單鏈抗體，并在已鑒定的單鏈抗體陽(yáng)性克隆中，篩選出對(duì)草魚(yú)IgM 有較好的特異性結(jié)合的單鏈抗體C1B3。結(jié)果表明，相對(duì)于病毒的其他結(jié)構(gòu)蛋白而言，VP7在草魚(yú)中能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，由此推導(dǎo)VP7 應(yīng)是用于疫苗設(shè)計(jì)的首選抗原。該研究通過(guò)單鏈抗體，為草魚(yú)呼腸孤病毒及其他魚(yú)類(lèi)病原體重組疫苗的研發(fā)提供了重要的分析手段和策略。張曉華等[20]利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大容量天然噬菌體展示單鏈抗體文庫(kù)成功獲取了能夠識(shí)別GCRV VP7 的單鏈抗體，此抗體將成為后面進(jìn)一步研究病毒與細(xì)胞相互作用的有效工具。

對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）為已知基因組最大的動(dòng)物病毒[21]，嚴(yán)重危害水生甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)。王曉潔等[22]從抗WSSV單抗的細(xì)胞株中，采用間接熒光檢測(cè)法篩選出8株分泌較強(qiáng)的抗WSSV單抗的細(xì)胞株，可用于白斑綜合癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的研制。試驗(yàn)采用雙抗夾心免疫層析法，制成快速檢測(cè)、診斷WSSV的試紙條，整個(gè)反應(yīng)只需5 min，與以前檢測(cè)WSSV較快的斑點(diǎn)免疫印跡法需要3 h相比，在很大程度上提高了檢測(cè)速度。白斑綜合癥病毒檢測(cè)試紙條是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、適合于現(xiàn)場(chǎng)使用的WSSV檢測(cè)、診斷試紙條，且無(wú)假陽(yáng)性。此試紙條尤其適于養(yǎng)殖人員現(xiàn)場(chǎng)、時(shí)事跟蹤、監(jiān)控、檢測(cè)，可為白斑癥的預(yù)防提供可靠的監(jiān)測(cè)依據(jù)。

2 噬菌體抗體庫(kù)在水環(huán)境監(jiān)控的研究

2.1 藥物殘留檢測(cè)

目前，用化學(xué)藥物和抗生素治療魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病是常用且較為有效的方法，但同時(shí)具有很多弊端，如藥物和抗生素在水產(chǎn)品中的殘留、病原生物耐藥性增強(qiáng)、水域生態(tài)污染等。在尋求病害防治的其他方法時(shí)，傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)獲得的抗體不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且制備過(guò)程較為復(fù)雜，無(wú)法滿足高通量的需要，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)獲得的抗體具有簡(jiǎn)單、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。

磺胺類(lèi)藥物（Sulfonamides，SAs）為化學(xué)合成抗菌藥，由于其具有廣譜抗菌活性，且價(jià)格低廉，應(yīng)用廣泛，在醫(yī)學(xué)和動(dòng)物的感染性疾病防治中具有重要地位，但不合理的使用容易引起過(guò)敏反應(yīng)[23]，造成耐藥菌增加，且動(dòng)物性食品中殘留的藥物可能對(duì)人們的健康造成潛在的危害[24]。趙琳等[25]成功構(gòu)建斑點(diǎn)叉尾鮰天然Fab噬菌體抗體庫(kù)，最終得到的庫(kù)容量約為5.67×107 cfu/ml。在此抗體庫(kù)的基礎(chǔ)上，閆曉敏等[26]以偶聯(lián)卵血清蛋白的磺胺甲氧嗦（OVA-SMP）和磺胺甲惡哇（OVA-SMZ）為固相包被抗原，篩選并獲得了特異性較強(qiáng)的Fab抗體。王輝等[27]成功建立了斑點(diǎn)叉尾蛔單鏈抗體（ScFv）抗體庫(kù)，并測(cè)定其庫(kù)容為5.8×105 cfu/ml。以O(shè)VA-SMZ為包被抗原，篩選到針對(duì)OVA-SMZ的抗體。

2.2 水質(zhì)監(jiān)測(cè)

在養(yǎng)殖過(guò)程中，投入過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、大量施肥和投餌等可導(dǎo)致水體中的氮、磷超標(biāo)，從而引起藻類(lèi)和浮游生物過(guò)度繁殖，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖的成活率。微囊藻素是從藍(lán)藻水華中分離出來(lái)的多肽毒素，能夠強(qiáng)烈抑制蛋白磷酸酶的活性，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖和水體環(huán)境的危害比較嚴(yán)重。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道微囊毒素對(duì)魚(yú)類(lèi)的危害，微囊毒素主要危害魚(yú)類(lèi)鰓、肝、腎、消化器官、循環(huán)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等[28]。Zhao等[29]利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)以微囊藻毒素為包被抗原，從構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)中成功篩選到特異性目標(biāo)抗體，得到的目標(biāo)抗體可以快速簡(jiǎn)單地對(duì)水體中微囊藻素進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在水體水質(zhì)檢測(cè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 噬菌體抗體庫(kù)在水產(chǎn)品安全控制的研究

長(zhǎng)久以來(lái)，河豚魚(yú)被認(rèn)為是東亞以及東南亞居民餐桌上一道美味的魚(yú)類(lèi)食物，但由于河豚毒素有劇毒，因此每年都會(huì)發(fā)生30～50例河豚魚(yú)中毒的事件[30]。河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是河豚魚(yú)中最主要的一種毒素成分。劉立才等[31]成功構(gòu)建抗河豚毒素（TTX）的重組的單鏈抗體（scFv）展示文庫(kù)，庫(kù)容量為 1.5×106 cfu/ml，經(jīng)過(guò)6輪的淘選過(guò)程，獲得了與河豚毒素特異性結(jié)合的抗體，該抗體庫(kù)的構(gòu)建為快速檢測(cè)河豚毒素提供了基礎(chǔ)。

在熱帶和亞熱帶海域珊瑚礁的附近，有400多種魚(yú)因食用毒藻類(lèi)而被毒化，其中包括梭魚(yú)、黑鱸和真鯛等重要海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，這些魚(yú)類(lèi)統(tǒng)稱(chēng)為雪卡魚(yú)。這些雪卡魚(yú)體內(nèi)都含有雪卡毒素，是一種可引起人類(lèi)中毒的珊瑚魚(yú)毒素，毒性極強(qiáng)，比河豚毒素的毒性強(qiáng)20倍[32]。雪卡毒素主要存在于肌肉、內(nèi)臟和生殖腺中，可引發(fā)神經(jīng)性中毒。Nagumo等[33]通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)成功篩選出抗雪卡魚(yú)毒素的特異性抗體，為今后雪卡魚(yú)毒素的研究及其檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

4 噬菌體抗體庫(kù)與抗體芯片結(jié)合的研究

抗體芯片（Antibody microarrays）是一種特殊的蛋白質(zhì)芯片，又稱(chēng)抗體微陣列，具有高特異性、高靈敏性、高通量及多樣品或多指標(biāo)平行分析的優(yōu)點(diǎn)，是免疫學(xué)研究的一種新技術(shù)，已被應(yīng)用到許多領(lǐng)域[34]。王欣欣等[35]用抗體芯片成功的對(duì)海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella bacterium）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、海洋分支桿菌（Nontuberculoaus mycobacteria）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、海洋分支桿菌（Nontuberculoaus mycobacteria）等6種細(xì)菌進(jìn)行了準(zhǔn)確檢測(cè)。在此試驗(yàn)中，應(yīng)用硫酸銨分級(jí)沉淀法進(jìn)行兔抗血清的純化，這能有效去除免疫血清中的非特異性抗體和雜蛋白，降低兔抗血清的非特異性吸附，從而使其與其他菌株的交叉反應(yīng)降到最低。通過(guò)ELISA對(duì)6種細(xì)菌與各菌株兔抗血清之間的交叉反應(yīng)，分析發(fā)現(xiàn)純化后交叉反應(yīng)明顯減小，用吸附純化后的抗體構(gòu)建的病原菌檢測(cè)抗體芯片的特異性顯著增強(qiáng)，因此可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的準(zhǔn)確檢測(cè)。廖瑋等[36]利用pⅧ展示系統(tǒng)成功改進(jìn)噬菌體抗體芯片，由于pⅧ N端有多個(gè)帶電氨基酸，會(huì)增加非特異性吸附，這些帶電氨基酸會(huì)被陽(yáng)性噬菌體上的融合抗體分子屏蔽，減少對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，從而降低了背景。降低pⅧ的非特異吸附，不僅可以提高芯片的靈敏度，而且可以降低非特異結(jié)合的背景，提高淘選效率，大幅度提高了噬菌體抗體芯片的靈敏度和信噪比，同時(shí)可為抗體庫(kù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新途徑。

5 展望

綜上所述，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景，已成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等問(wèn)題的重要手段。同時(shí)隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的日益發(fā)展，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用也具有廣闊的前景。但是，由于抗體庫(kù)技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域上的應(yīng)用處于初步發(fā)展階段，因此需要投入大量的人力和物力來(lái)開(kāi)拓、優(yōu)化可用的抗體庫(kù)?？傊?，抗體庫(kù)技術(shù)作為一項(xiàng)新興的技術(shù)，必將在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的基礎(chǔ)研究及其實(shí)際應(yīng)用上產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

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