類(lèi)烏齊牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因克隆與組織表達(dá)分析

鐘 美，王吉坤，柴志欣，王 會(huì)，王嘉博，武志娟，信金偉，張成福，姬秋梅，鐘金城

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000)

牦牛(Bosgrunniens) 耐粗耐勞，具有極強(qiáng)的生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性，在氧氣稀薄、天氣寒冷、牧草匱乏等惡劣環(huán)境條件下均可生存、繁衍后代，是極為寶貴的遺傳資源基因庫(kù)[1-3]。類(lèi)烏齊牦牛主要生存于海拔3 700 m以上的高原，因其遺傳多樣性豐富，肉質(zhì)鮮美，在2017年通過(guò)了國(guó)家畜禽資源委員會(huì)審定，評(píng)為優(yōu)良的牦牛遺傳資源[4]。

補(bǔ)體C1q(Complement 1)分子是由6個(gè)亞單位組成的異源六聚體，每個(gè)亞單位分別由C1QA、C1QB、C1QC基因編碼的A、B、C 3條多肽鏈組成，即C1q 由18條多肽鏈構(gòu)成[5]。鏈間靠3條鏈的N端半胱氨酸形成二硫鍵相連，構(gòu)成同一個(gè)亞單位中的A-B 二聚體以及2個(gè)亞單位間的C-C二聚體，因此組成6個(gè)A-B二聚體和3個(gè)C-C二聚體。兩A-B二聚體和一個(gè)C-C二聚體以非共價(jià)鍵形成含有2A、2B和2C的結(jié)構(gòu)單位，3個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)單位憑借非共價(jià)鍵構(gòu)成完整的 C1q 分子[6]。補(bǔ)體系統(tǒng)是由存在于動(dòng)物血清和組織液中的一組可溶性蛋白以及存在于其他細(xì)胞表面的一組膜結(jié)合蛋白和補(bǔ)體受體組成的，是一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)，在機(jī)體的抗感染免疫防御、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、氧化應(yīng)激、糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。C1q是分子量為460 ku的糖蛋白，是C1的第一組成成分，對(duì)病原體的清除和細(xì)胞凋亡等重要生物過(guò)程至關(guān)重要[7]，同時(shí)是啟動(dòng)補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑的重要識(shí)別分子，在天然免疫和特異性免疫之間發(fā)揮連接作用[8]。

目前，C1QA、C1QB、C1QC基因在人[9]、牛[10]、豬[11]、鼠[12]等哺乳動(dòng)物中均已得到廣泛研究，多與疾病相關(guān)，在綿羊各個(gè)組織中也均有表達(dá)[13]，該基因在牦牛中的研究鮮有報(bào)道。補(bǔ)體C1q蛋白與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫性腎病等免疫疾病[14]和缺氧條件下血管生成、促進(jìn)缺血心肌新生血管形成等低氧適應(yīng)有關(guān)[15-16]。如在Tohgi等[17]研究中發(fā)現(xiàn)小鼠PC12細(xì)胞在缺氧后立即表達(dá)C1q mRNA，然后在復(fù)氧過(guò)程中翻譯出C1q蛋白的A、B、C鏈，導(dǎo)致缺氧細(xì)胞受損。Luo等[18]發(fā)現(xiàn)缺氧后C1q沉積是誘導(dǎo)阿爾茨海默病(AD)中神經(jīng)元氧化應(yīng)激和神經(jīng)元死亡的重要因素，進(jìn)一步證實(shí)了C1q是導(dǎo)致缺氧細(xì)胞受損傷的重要原因。Bossi等[19]研究表明，C1q與糖尿病患者慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合及缺氧條件下腦損傷的血管生成有關(guān)。Fan等[20]研究結(jié)果顯示，C1q可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)和分泌，通過(guò)LAIR-HIF1α-VEGF軸(重組人白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1-缺氧誘導(dǎo)因子α-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)增強(qiáng)大腦動(dòng)脈閉塞大鼠的血管新生以減輕腦水腫，由此可知，在缺氧狀態(tài)下C1q確實(shí)能促進(jìn)血管的生成。在維持機(jī)體的免疫耐受[21]方面，C1q 可識(shí)別許多自身結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的配體，如β淀粉樣蛋白纖維[22]、凋亡細(xì)胞[23]、低密度脂蛋白修飾形式[24]和朊病毒蛋白病理形式[25]，C1q 分子與這些配體結(jié)合可快速啟動(dòng)細(xì)胞的吞噬作用，從而清除凋亡細(xì)胞，抑制溶解效應(yīng)和炎癥。另一方面毋文靜[26]研究發(fā)現(xiàn)CTRP6(一種脂肪分泌因子，屬于補(bǔ)體C1q相關(guān)蛋白家族)通過(guò)Erk1/2和p38MAPK信號(hào)通路可調(diào)控豬肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞的分化，以及皮下脂肪細(xì)胞的增殖。

缺氧組織中由于補(bǔ)體C1q沉積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞病變，研究表明神經(jīng)元受β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta，Aβ)[27]、谷氨酰胺[28]、機(jī)械損傷[29]、超氧化物歧化酶(SOD)變異[30]以及單純皰疹病毒感染[31]等因素刺激可產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物(ROS)，而補(bǔ)體C1q蛋白可通過(guò)細(xì)胞表面受體促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用并刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS， ROS過(guò)量會(huì)干擾細(xì)胞的正常功能[32]。趙杰等[33]研究顯示肝臟器官中發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，含量過(guò)多的ROS會(huì)使細(xì)胞的抗氧化防御能力有所衰減。ROS可通過(guò)激活NF-κB、TGFβ、Nrf2等相關(guān)信號(hào)分子、細(xì)胞因子及其下游信號(hào)通路調(diào)控肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，如Nrf2作為調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)肝臟中解毒和抗氧化防御相關(guān)基因的表達(dá)[34]，在氧化應(yīng)激的刺激下，Nrf2磷酸化后與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelchlike ECH-associated protein 1，Keap1)解離，進(jìn)入到細(xì)胞核后與抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response elements，ARE) 序列結(jié)合，發(fā)揮抗氧化作用[35]，所以C1q蛋白可以激活Nrf2，使得機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)增強(qiáng)。

本研究以類(lèi)烏齊牦牛為研究對(duì)象，通過(guò)克隆其C1QA、C1QB、C1QC基因的CDS區(qū)，并對(duì)CDS區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其信號(hào)肽、親水性/疏水性、跨膜區(qū)、理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)，實(shí)時(shí)熒光定量分析其在不同組織中的表達(dá)情況，為更進(jìn)一步探討C1QA、C1QB、C1QC基因在牦牛低氧適應(yīng)性中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 采集樣本 本試驗(yàn)樣本取自西藏昌都市類(lèi)烏齊縣，挑選身體健康的6月齡牦牛3頭，采集脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肺臟組織，組織使用DEPC水預(yù)處理，放于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 pMDTM19-T Vector cloning Kit、YB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ，購(gòu)自TaKaRa公司；DNA 純化回收試劑盒、DL-2000 Marker、大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中牦牛C1QA(XM_005905182.20)、C1QB(XM_005905180.2)、C1QC(XM_005905183)基因mRNA 的預(yù)測(cè)序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物(表1)由擎科生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.2.2 樣品RNA提取及檢測(cè) 將各組織樣本，利用液氮于研缽中研磨至粉末狀后移入1.5 mL無(wú)RNase離心管中，TRIzol(Invitrogen)試劑1 mL溶解，根據(jù)TRIzol法提取總RNA。使用NanoDropTMOne 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的純度和濃度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) (TaKaRa)使用說(shuō)明，將提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4C1QA、C1QB、C1QC基因PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系(25 μL)：cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，TaqGreen PCR Master Mix(2×)12. 5 μL。反應(yīng)程序參見(jiàn)文獻(xiàn)[36]。PCR產(chǎn)物用1.0%凝膠電泳檢測(cè)后根據(jù)DNA純化試劑盒使用說(shuō)明純化回收DNA。

1.2.5 克隆及測(cè)序 pMD19-T載體與純化后的PCR產(chǎn)物連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐的LB 固體培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)10～14 h；選取白色菌落置于液體培養(yǎng)基中，37 ℃/(180 r/min)搖床中培養(yǎng)；用菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆，送擎科生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用在線(xiàn)軟件(表2)對(duì)C1QA、C1QB、C1QC蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)

利用YB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ試劑(TaKaRa)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)C1QA、C1QB、C1QC基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等組織的相對(duì)表達(dá)量。

反應(yīng)體系 (10 μL)：YB GreenTMPremix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，無(wú)RNAase水3. 4 μL。反應(yīng)程序參見(jiàn)文獻(xiàn)[36]。利用熔解曲線(xiàn)來(lái)鑒定引物特異性，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)。以牦牛β-actin為內(nèi)參基因，記錄每個(gè)樣品的Ct值，利用 2-ΔΔCt法得到各個(gè)樣本的相對(duì)表達(dá)量。

表2 在線(xiàn)分析軟件Tab.2 Online analysis software

利用GraphPad Prism 5繪制C1QA、C1QB、C1QC基因在類(lèi)烏齊牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織中的相對(duì)表達(dá)柱狀圖，根據(jù)SPSS 22.0軟件分析得到各組織間的差異顯著性，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因克隆

牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，分別獲得835，945，850 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果(表1)相符。

M.DL2000 DNA Marker；1-3.C1QA、C1QC、C1QB基因。M.DL2000 DNA Marker；1-3.C1QA，C1QC，C1QB genes，respectively.

2.2 同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

利用DNAMAN軟件將克隆獲得牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因CDS區(qū)與普通牛、水牛、野豬、人、卡氏小鼠和高原地山雀基因的CDS區(qū)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，牦牛C1QA基因與普通牛(XM_001014945.2)、水牛(XM_006063784.2)、野豬(XM_001003924.1)、人(XM_001347465.2)、卡氏小鼠(XM_021160797.2)、高原地山雀(XM_065528281.2)的序列一致性分別為99.0%，95.9%，30.7%，67.3%，60.4%和28.3%；牦牛C1QB基因與普通牛(XM_001046599.2)、水牛(XM_006063788.2)、野豬(XM_001244283.1)、人(XM_001371184.1)、卡氏小鼠(XM_021160680.2)、高原地山雀(XM_005528279.2)的一致性分別為99.3%，97.2%，28.3%，34.7%，29.3%和34.2%；牦牛C1QC基因與普通牛(XM_001206396.1)、水牛(XM_025278760.1)、野豬(XM_001244286.1)、人(XM_001114101.3)、卡氏小鼠(XM_021160901.2)、高原地山雀(XM_014257216.1)的一致性分別為82.7%，84.1%，81.3%，100.0%，77.9%和63.9%。

利用ClustalX和MAGA 5.2構(gòu)建類(lèi)烏齊牦牛(Lwq yak)與水牛(Bubalusbubalis)、普通牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes)、卡氏小鼠(Muscaroli)、野豬(Susscrofa)、藏羚羊(Pantholopshodgsonii)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、青藏高原蛙(Nanoranaparkeri)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)和高原地山雀(Tibetan ground-tit)C1QA、C1QB、C1QC基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果(圖2-4)表明，類(lèi)烏齊牦牛C1QA、C1QB基因最先與普通牛、水牛、藏羚羊聚為一類(lèi)，其次是卡氏小鼠、人、黑猩猩等其他動(dòng)物，而類(lèi)烏齊牦牛C1QC基因卻最先與人、長(zhǎng)尾獼猴、野豬聚為一類(lèi)，其次是水牛、普通牛等其他動(dòng)物，說(shuō)明類(lèi)烏齊牦牛C1QA、C1QB基因與普通牛親緣關(guān)系最近，類(lèi)烏齊牦牛C1QC基因則與人親緣關(guān)系最近，類(lèi)烏齊牦牛C1QA基因與野豬、高原地山雀親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，類(lèi)烏齊牦牛C1QB、C1QC基因與斑馬魚(yú)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 序列分析結(jié)果

使用NCBI ORF Finder對(duì)克隆所得牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析，可知C1QA基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)735 bp，共編碼244個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA；C1QB基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)744 bp，共編碼247個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA；C1QC基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)732 bp，編碼243個(gè)氨基酸。

圖2 11個(gè)不同物種基于C1QA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on C1QA gene sequences of 11 species

圖3 12個(gè)不同物種基于C1QB基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on C1QB gene sequences of 12 species

圖4 10個(gè)不同物種基于C1QC基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on C1QC gene sequences of 10 species

2.4 牦牛C1QA、C1QB、C1QC蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

2.4.1 理化性質(zhì) 根據(jù)在線(xiàn)軟件ExPASy Prot-Param 程序預(yù)測(cè)C1QA、C1QB、C1QC蛋白的理化性質(zhì)。預(yù)測(cè)結(jié)果(表3)顯示，C1QA、C1QB和C1QC蛋白所含氨基酸殘基以甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)最多；不穩(wěn)定系數(shù)分別為34.11，18.79和28.77，均屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)分別為66.68，72.59和67.74，總平均親水系數(shù)分別為-0.386，-0.353和-0.298，依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)或分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律分析可知， C1QA、C1QB和C1QC蛋白整體表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性，屬親水性蛋白。

2.4.2 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 利用軟件SignalP 5.0、TMHMM、Interpro和NetPhos 2.0在線(xiàn)工具分別預(yù)測(cè)C1QA、C1QB和C1QC蛋白質(zhì)的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果顯示，C1QA、C1QB和C1QC蛋白均含有信號(hào)肽和C1Q結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)域；蛋白氨基酸序列中分別存在18，21，15 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中C1QA編碼的氨基酸含有12個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)Tyr 磷酸化位點(diǎn)；C1QB包含10個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)；C1QC檢測(cè)到8個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)。

表3 C1QA、C1QB、C1QC蛋白序列分析Tab.3 Analysis of C1QA，C1QB and C1QC genes sequences

利用ExPaSy中SOPMA、SWISS-MODEL和PSORTⅡPrediction工具預(yù)測(cè)C1QA、C1QB和C1QC蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示C1QA、C1QB和C1QC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，比例分別為61.85%，63.97%，66.67%，其中在蛋白結(jié)構(gòu)相似性比對(duì)中C1QA與5hkj.1結(jié)構(gòu)具有75.71% 的相似性，C1QB、C1QC與5hkj.1結(jié)構(gòu)相似性分別可達(dá)73.33% 和74.81%；三級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成(圖5-7)；蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，C1QA、C1QB、C1QC位于細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)的比例分別為55.6%，66.7%，66.7%，C1QA與C1QB位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體各占11.1%，C1QB、C1QC位于高爾基體所分泌的囊泡中分別占11.1%和22.2%，C1QA位于細(xì)胞骨架、細(xì)胞核內(nèi)各占11.1%，C1QC還有11.1%位于線(xiàn)粒體。

圖5 牦牛C1QA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 The tertiary structure prediction of C1QA protein in Bos grunniens

圖6 牦牛C1QB蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 The tertiary structure prediction of C1QB protein in Bos grunniens

圖7 牦牛C1QC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 The tertiary structure prediction of C1QC protein in Bos grunniens

2.4.3 功能預(yù)測(cè) 通過(guò)蛋白功能預(yù)測(cè)分析，C1QA、C1QB和C1QC蛋白的主要功能包括細(xì)胞表面受體信號(hào)通路的調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)等(表4)。

表4 C1QA、C1QB、C1QC蛋白功能分析Tab.4 The functional analysis of C1QA， C1QB and C1QC protein in Bos grunniens %

2.4.4 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析 C1QA、C1QB和C1QC蛋白是組成C1Q蛋白的3條鏈，均含有C1Q結(jié)構(gòu)域，相關(guān)性較高，以C1QC蛋白為例，C1QA和C1QC的相關(guān)性為0.976，C1QB與C1QC間的相關(guān)性為0.996，補(bǔ)體系統(tǒng)第一成分的S亞成分(C1S)和C1QC的相關(guān)性可達(dá)0.910，SERPING1是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的G1成員，與C1QC的相關(guān)性為0.864，蛋白酪氨酸激酶結(jié)合蛋白(TYROBP)與C1QC間的相關(guān)性可達(dá)0.815，組織蛋白酶S(CTSS)為木瓜蛋白酶超家族成員，在抗原遞呈中起重要作用，并可水解多種蛋白，參與多種疾病的病理過(guò)程，與C1QC的相關(guān)性達(dá)到了0.805(圖8)。

圖8 C1QA、C1QB、C1QC蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析圖Fig.8 C1QA，C1QB，C1QC protein network interaction analysis

2.5 C1QA、C1QB、C1QC基因在類(lèi)烏齊牦牛各組織中的差異表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)類(lèi)烏齊牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織中C1QA、C1QB、C1QC基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，用2-ΔΔCt法計(jì)算C1QA、C1QB、C1QC基因表達(dá)量，結(jié)果(圖9-11)表明：C1QA、C1QB、C1QC基因在所檢測(cè)組織中均有表達(dá)，在肺臟中C1QB基因的表達(dá)量最高，C1QA次之，C1QC基因的表達(dá)量最低，其中類(lèi)烏齊牦牛C1QA、C1QB基因在脾臟、肺臟中的表達(dá)量極顯著高于心臟、肝臟和腎臟中的表達(dá)量(P<0.01)；C1QC基因在肺臟中的表達(dá)量極顯著高于心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的表達(dá)量(P<0.01)，在心臟中的表達(dá)量極顯著低于脾臟和肝臟(P<0.01)，顯著高于腎臟(P<0.05)；C1QA、C1QB基因在心臟、肝臟和腎臟中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01);不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05);相同字母表示差異不顯著。圖10-11同。

圖10 牦牛C1QB基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Tissue expression of C1QB gene in different tissues in Bos grunniens

圖11 牦牛C1QC基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.11 Tissue expression of C1QC gene in different tissues in Bos grunniens

3 討論與結(jié)論

全世界約有牦牛1 600萬(wàn)頭，中國(guó)是世界上擁有牦牛數(shù)量和品種類(lèi)群最多的國(guó)家，約占世界牦?？倲?shù)的95%以上，占中國(guó)牛只總數(shù)的1/6。牦牛作為一種“全能”家畜，對(duì)人類(lèi)有著不可忽視的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)意義。本研究通過(guò)對(duì)類(lèi)烏齊牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因的克隆、生物信息學(xué)分析與組織表達(dá)分析，為今后補(bǔ)體C1q蛋白在牦牛低氧適應(yīng)研究提供依據(jù)，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)和利用類(lèi)烏齊牦牛遺傳資源奠定基礎(chǔ)。將類(lèi)烏齊牦牛與水牛、普通牛、人、黑猩猩、卡氏小鼠、野豬、藏羚羊、非洲爪蟾、青藏高原蛙、斑馬魚(yú)和高原地山雀的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因在反芻動(dòng)物間具有高度保守性。

本研究顯示牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白甘氨酸含量為15.2%，13.4%，16.5%。甘氨酸含量越高，機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力越強(qiáng)；另一方面，由于缺氧會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)C1q的沉積，C1q增多促使體內(nèi)ROS增加，而甘氨酸作為內(nèi)源性抗氧化劑還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，對(duì)活性氧(ROS) 有很強(qiáng)的清除作用，因此，牦牛體內(nèi)甘氨酸的含量影響其對(duì)高海拔低氧環(huán)境的適應(yīng)。脯氨酸親水性極強(qiáng)，可降低凝固點(diǎn)防止細(xì)胞脫水從而能穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)及組織內(nèi)的代謝過(guò)程，同時(shí)作為能量庫(kù)調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原；在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，脯氨酸可作為抗寒育種的生理指標(biāo)[37]。本研究表明，牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白脯氨酸含量為9.8%，9.3%，10.7%，表明類(lèi)烏齊牦牛體內(nèi)脯氨酸的含量可能是導(dǎo)致其適應(yīng)高海拔低溫環(huán)境的重要因素。

信號(hào)肽是指導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移(定位)的短肽鏈，可與膜上蛋白受體結(jié)合，指引蛋白質(zhì)被運(yùn)輸?shù)教囟ㄎ恢?，而結(jié)構(gòu)域是生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)和獨(dú)立功能的區(qū)域。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)到牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白含有C1Q結(jié)構(gòu)域與一條信號(hào)肽，說(shuō)明補(bǔ)體C1q蛋白的功能較保守，牦牛在補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑的免疫調(diào)節(jié)中與其他物種是一致的。胞內(nèi)的信號(hào)蛋白主要分為兩大類(lèi)：一類(lèi)在蛋白激酶的作用下磷酸化，共價(jià)結(jié)合ATP所提供的磷酸基團(tuán)；另一類(lèi)則在信號(hào)作用下結(jié)合GTP，使得GTP取代GDP，這2種胞內(nèi)信號(hào)蛋白會(huì)在信號(hào)達(dá)到時(shí)獲得磷酸基團(tuán)而被激活，在信號(hào)減弱時(shí)去除這些基團(tuán)，從而失活。在信號(hào)中繼網(wǎng)中，這種某個(gè)信號(hào)蛋白磷酸化從而造成下游蛋白依次發(fā)生磷酸化的過(guò)程稱(chēng)為磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白磷酸化位點(diǎn)為18，21，15個(gè)且均有信號(hào)肽，說(shuō)明牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白是信號(hào)蛋白，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)傳遞，協(xié)調(diào)和控制相關(guān)代謝和生命活動(dòng)。近年來(lái)磷酸化在低溫脅迫上的研究數(shù)不勝數(shù)，Zhao等[38]利用蛋白磷酸化技術(shù)探究了低溫脅迫下植物生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)機(jī)制；楊梅燕[39]研究表明在凍融脅迫下，PM18蛋白可有效降低乳酸脫氫酶的活性喪失比率，且磷酸化后的PM18蛋白對(duì)乳酸脫氫酶的保護(hù)能力比非磷酸化的PM18蛋白更好，牦牛作為生存在高原低溫、低氧等惡劣環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)物種，探討牦牛低溫脅迫的調(diào)控機(jī)制有利于牦牛遺傳資源的開(kāi)發(fā)與利用。

蛋白功能預(yù)測(cè)分析顯示，牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白的功能包括細(xì)胞表面受體信號(hào)通路的調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞定位等，這些功能預(yù)測(cè)與本研究對(duì)C1QA、C1QB和C1QC蛋白的生物信息學(xué)分析所得結(jié)果相對(duì)應(yīng)。牦牛由于對(duì)高原環(huán)境的適應(yīng)，在機(jī)體代謝上勢(shì)必與其他物種存在差異，牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白對(duì)于代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)幾率達(dá)到了84.7%，84.0%和81.7%，但關(guān)于其對(duì)牦牛代謝過(guò)程的調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。蛋白質(zhì)互作分析中，由于C1QA、C1QB和C1QC蛋白是補(bǔ)體C1q的構(gòu)成蛋白，三者相關(guān)性達(dá)到了0.90以上，C1QC與補(bǔ)體第一成分的S亞成分(C1S)的相關(guān)性亦達(dá)到了0.901，是因?yàn)镃1q的膠原樣區(qū)與兩分子的補(bǔ)體第一成分的r亞成分(C1R )和 C1S 結(jié)合而形成C1大分子(C1QC1R2C1S2)，再通過(guò)C1q球狀結(jié)構(gòu)域識(shí)別與Ig G或IgM免疫復(fù)合體結(jié)合，激活C1R和C1S，進(jìn)而啟動(dòng)補(bǔ)體經(jīng)典途徑。蛋白酪氨酸激酶是一類(lèi)催化ATP上γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化中具有重要作用；蛋白質(zhì)互作顯示蛋白酪氨酸激酶結(jié)合蛋白(TYROBP)與C1QC間相關(guān)性達(dá)0.815，蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白酪氨酸磷酸化位點(diǎn)為2，3，2個(gè)，表明牦牛C1QA、C1QB和C1QC蛋白有可能是通過(guò)酪氨酸磷酸化參與調(diào)控牦牛細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分化。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，C1QA、C1QB基因在肺臟和脾臟中表達(dá)量最高，心臟、肝臟與腎臟三者間表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，與Jiang等[13]發(fā)現(xiàn)綿羊脾臟中表達(dá)量最高，其次是肺臟的研究結(jié)果基本一致；與Yue等[40]發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟中表達(dá)量最高，在肺臟與肝臟、心臟和腎臟中的表達(dá)量差異不顯著的研究結(jié)果存在差異，說(shuō)明C1QA、C1QB基因的組織表達(dá)具有物種特異性，反芻動(dòng)物中C1QA、C1QB基因在肺臟中的表達(dá)量要高于肝臟、心臟和腎臟；而脾是重要的淋巴器官，可以制造免疫球蛋白、補(bǔ)體等免疫物質(zhì)，發(fā)揮免疫作用，也是人體的“血庫(kù)”，當(dāng)人體休息、安靜時(shí)貯存血液，當(dāng)處于運(yùn)動(dòng)、失血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)又將血液排送到血循環(huán)中，以增加血容量，所以C1QA、C1QB基因在不同物種的脾臟中表達(dá)量都比較高；在牦牛肺臟組織中表達(dá)量與其他物種存在差異的原因可能是C1QA、C1QB基因參與調(diào)控牦牛肺部低氧適應(yīng)機(jī)制。C1QC基因在肺臟中表達(dá)量極顯著高于脾臟和肝臟，在心臟與腎臟中表達(dá)量較低，與Jiang等[13]發(fā)現(xiàn)綿羊脾臟中表達(dá)量最高，其次是肺臟，及Yue等[40]發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟中表達(dá)量最高，在肺臟與肝臟、心臟和腎臟中的表達(dá)量差異不顯著的研究結(jié)果存在差異，說(shuō)明C1QC基因的組織表達(dá)也具有物種特異性，但C1QC基因在脾臟與腎臟中的表達(dá)量與在C1QA、C1QB基因中的相比，肺臟顯著高于脾臟，可能是因?yàn)镃1QC基因在調(diào)控牦牛肺部低氧適應(yīng)機(jī)制中承擔(dān)著不同的作用。

本研究首次從類(lèi)烏齊牦牛肺臟組織中克隆出牦牛C1QA、C1QB、C1QC基因，其CDS區(qū)全長(zhǎng)分別為735，744，732 bp，分別編碼244，247，243個(gè)氨基酸；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，C1QA、C1QB基因與普通牛、水牛親緣關(guān)系最近，C1QC基因則與人的親緣關(guān)系最近；熒光定量結(jié)果表明，C1QA、C1QB基因在脾臟、肺臟中的表達(dá)量極顯著高于心臟、肝臟和腎臟中的表達(dá)量(P<0.01)，C1QC基因則是肺臟中的表達(dá)量極顯著高于心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的表達(dá)量(P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果為深入研究C1QA、C1QB、C1QC基因在牦牛高原適應(yīng)中的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。