使用ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)和ACQUITY QDa檢測器篩查牛奶中氯霉素

氯霉素是一種價(jià)格廉宜的廣譜抗生素。氯霉素在某些易感個(gè)體中涉及毒性作用。作為致癌物質(zhì)和基因毒性化合物的可疑對(duì)象，氯霉素相關(guān)的再生障礙性貧血（骨髓抑制）致命病例已有廣泛記載。因此，在歐盟、加拿大、美國以及一些亞洲和南美國家均禁止將其用于食用性動(dòng)物、昆蟲和水產(chǎn)養(yǎng)殖。歐盟委員會(huì)指令2003/181/EC規(guī)定，任何用于檢測食品中氯霉素的方法的最小性能限值（MRPL）為0.3μg/kg。

由于產(chǎn)品保質(zhì)期較短，需要快速的處理時(shí)間，因此乳制品檢測實(shí)驗(yàn)室以往都采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)大量樣品進(jìn)行篩查。雖然ELISA可以對(duì)氯霉素進(jìn)行靈敏而快速的篩查，但它的一個(gè)缺點(diǎn)是假陽性結(jié)果很多，據(jù)報(bào)某些案例中的假陽性水平達(dá)到16%。

免疫吸附劑與干擾基質(zhì)之間的交叉反應(yīng)經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致牛奶中氯霉素的誤檢，從而造成不必要的產(chǎn)品銷毀。質(zhì)譜檢測可以提高選擇性，有助于區(qū)分氯霉素和污染基質(zhì)。此外，質(zhì)譜檢測結(jié)合液相色譜（LC）可以避免采用氣相色譜法篩查氯霉素時(shí)所需的費(fèi)時(shí)衍生化處理步驟。為了讓實(shí)驗(yàn)室能夠充分利用這些優(yōu)勢，近期的技術(shù)進(jìn)展著重于提高儀器可用性和穩(wěn)定性。ACQUITY QDa檢測器易于使用，不需要專業(yè)的質(zhì)譜知識(shí)，因而可以方便地整合到LC工作流程中。

應(yīng)用優(yōu)勢

提供了一種牛奶中氯霉素的快速篩查方法。對(duì)檢測結(jié)果低于規(guī)定限值的樣品進(jìn)行定量篩查。

對(duì)管制抗生素進(jìn)行簡單而靈敏的檢測。

將質(zhì)譜檢測簡便應(yīng)用于現(xiàn)有LC工作流程。

實(shí)驗(yàn)

UPLC條件

LC：ACQUITY UPLC I-Class；

運(yùn)行時(shí)間：5min；

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18，1.8μm，2.1×100mm；

流動(dòng)相：10mM醋酸銨的45∶5甲醇/水溶液；

進(jìn)樣體積：10μL。

檢測條件

檢測器：ACQUITY QDa；電離模式：ESI；

SIR通道：m/z 321.0；

錐孔電壓：15V；

探頭溫度：缺?。?00℃）；毛細(xì)管電壓：缺?。?.8kV）；采樣速率：缺?。?Hz）。

樣品制備

稱取半脫脂牛奶（5g）樣品，裝入25mL離心管中，強(qiáng)化至濃度達(dá)到0.3μg/kg。通過向樣品中添加己烷（5mL）和70%乙腈溶液（15mL），完成脂肪去除和蛋白質(zhì)沉淀。振搖樣品，然后在3900G（4℃）下離心10min。去除下面的乙腈層（5mL），然后用10%甲醇稀釋至總體積為15mL。

使用甲醇（2mL）和水（4mL）對(duì)Oasis HLB 3cc（60mg）小柱進(jìn)行平衡。將稀釋后的樣品（15mL）加載到小柱上，然后用5%甲醇溶液（6mL）清洗小柱。使用100%甲醇（6mL）洗脫氯霉素。隨后將洗脫液在氮?dú)庵姓舭l(fā)，用10%甲醇溶液（300μL）復(fù)溶后轉(zhuǎn)入LC-MS分析。

標(biāo)準(zhǔn)品制備

采用上述樣品制備方法制備空白牛奶樣品（未強(qiáng)化）。將空白基質(zhì)樣品在氮?dú)庵懈稍锖?，使用不同濃度的?biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，以建立范圍相當(dāng)于0.075～1μg/kg的6點(diǎn)校準(zhǔn)曲線。

結(jié)果與討論

在分析牛奶提取物之前，調(diào)試氯霉素的最佳源條件，確定ACQUITY QDa檢測器的預(yù)優(yōu)化源參數(shù)可以提供最有效和最靈敏的檢測結(jié)果。氯霉素在15V錐孔電壓的負(fù)離子模式下靈敏度最高。使用上述方法，通過基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線可以對(duì)歐盟MRPL的強(qiáng)化牛奶樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。在0.075～1μg/kg的選定工作范圍內(nèi)，氯霉素具有出色的線性（R2>0.995），如圖1所示。

為了評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，將基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線與相同范圍的溶劑校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。圖2顯示了基質(zhì)匹配和溶劑校準(zhǔn)曲線的疊加圖。從該疊加圖中可以明顯看出基質(zhì)效應(yīng)（離子增強(qiáng)）。通過統(tǒng)計(jì)方法也可以證實(shí)存在基質(zhì)效應(yīng)，利用各校準(zhǔn)曲線的斜率（樣品斜率/標(biāo)準(zhǔn)品斜率X100），計(jì)算出基質(zhì)效應(yīng)為177%。盡管存在基質(zhì)效應(yīng)，使用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線仍然可以對(duì)牛奶中的氯霉素實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量篩查。

對(duì)空白牛奶平行樣品進(jìn)行分析，未檢出假陽性。圖3A顯示了一個(gè)空白提取樣的色譜圖示例，圖中只觀察到基線噪音。對(duì)于歐盟M R PL強(qiáng)化4個(gè)平行牛奶樣品，樣品提取后進(jìn)行重復(fù)分析（不使用價(jià)格昂貴的氘代內(nèi)標(biāo)）（n=8）。對(duì)照基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線對(duì)最終樣品進(jìn)行定量。圖3B顯示了強(qiáng)化濃度（0.3μg/kg）下平行樣的氯霉素峰，峰間信噪比（S/N）≥50，達(dá)到良好水平。

結(jié)論

本文開發(fā)了一種用于定量篩查牛奶中氯霉素的準(zhǔn)確、穩(wěn)定的方法。這種方法經(jīng)證實(shí)可在無內(nèi)標(biāo)的情況下輕松達(dá)到法規(guī)要求的檢測水平，同時(shí)在歐盟MRPL（0.3μg/kg）水平下表現(xiàn)出優(yōu)異的重復(fù)性。質(zhì)譜額外的檢測區(qū)分能力提高了結(jié)果的特異性，未檢出假陽性。endprint

氯霉素是一種價(jià)格廉宜的廣譜抗生素。氯霉素在某些易感個(gè)體中涉及毒性作用。作為致癌物質(zhì)和基因毒性化合物的可疑對(duì)象，氯霉素相關(guān)的再生障礙性貧血（骨髓抑制）致命病例已有廣泛記載。因此，在歐盟、加拿大、美國以及一些亞洲和南美國家均禁止將其用于食用性動(dòng)物、昆蟲和水產(chǎn)養(yǎng)殖。歐盟委員會(huì)指令2003/181/EC規(guī)定，任何用于檢測食品中氯霉素的方法的最小性能限值（MRPL）為0.3μg/kg。

由于產(chǎn)品保質(zhì)期較短，需要快速的處理時(shí)間，因此乳制品檢測實(shí)驗(yàn)室以往都采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)大量樣品進(jìn)行篩查。雖然ELISA可以對(duì)氯霉素進(jìn)行靈敏而快速的篩查，但它的一個(gè)缺點(diǎn)是假陽性結(jié)果很多，據(jù)報(bào)某些案例中的假陽性水平達(dá)到16%。

免疫吸附劑與干擾基質(zhì)之間的交叉反應(yīng)經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致牛奶中氯霉素的誤檢，從而造成不必要的產(chǎn)品銷毀。質(zhì)譜檢測可以提高選擇性，有助于區(qū)分氯霉素和污染基質(zhì)。此外，質(zhì)譜檢測結(jié)合液相色譜（LC）可以避免采用氣相色譜法篩查氯霉素時(shí)所需的費(fèi)時(shí)衍生化處理步驟。為了讓實(shí)驗(yàn)室能夠充分利用這些優(yōu)勢，近期的技術(shù)進(jìn)展著重于提高儀器可用性和穩(wěn)定性。ACQUITY QDa檢測器易于使用，不需要專業(yè)的質(zhì)譜知識(shí)，因而可以方便地整合到LC工作流程中。

應(yīng)用優(yōu)勢

提供了一種牛奶中氯霉素的快速篩查方法。對(duì)檢測結(jié)果低于規(guī)定限值的樣品進(jìn)行定量篩查。

對(duì)管制抗生素進(jìn)行簡單而靈敏的檢測。

將質(zhì)譜檢測簡便應(yīng)用于現(xiàn)有LC工作流程。

實(shí)驗(yàn)

UPLC條件

LC：ACQUITY UPLC I-Class；

運(yùn)行時(shí)間：5min；

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18，1.8μm，2.1×100mm；

流動(dòng)相：10mM醋酸銨的45∶5甲醇/水溶液；

進(jìn)樣體積：10μL。

檢測條件

檢測器：ACQUITY QDa；電離模式：ESI；

SIR通道：m/z 321.0；

錐孔電壓：15V；

探頭溫度：缺?。?00℃）；毛細(xì)管電壓：缺?。?.8kV）；采樣速率：缺省（5Hz）。

樣品制備

稱取半脫脂牛奶（5g）樣品，裝入25mL離心管中，強(qiáng)化至濃度達(dá)到0.3μg/kg。通過向樣品中添加己烷（5mL）和70%乙腈溶液（15mL），完成脂肪去除和蛋白質(zhì)沉淀。振搖樣品，然后在3900G（4℃）下離心10min。去除下面的乙腈層（5mL），然后用10%甲醇稀釋至總體積為15mL。

使用甲醇（2mL）和水（4mL）對(duì)Oasis HLB 3cc（60mg）小柱進(jìn)行平衡。將稀釋后的樣品（15mL）加載到小柱上，然后用5%甲醇溶液（6mL）清洗小柱。使用100%甲醇（6mL）洗脫氯霉素。隨后將洗脫液在氮?dú)庵姓舭l(fā)，用10%甲醇溶液（300μL）復(fù)溶后轉(zhuǎn)入LC-MS分析。

標(biāo)準(zhǔn)品制備

采用上述樣品制備方法制備空白牛奶樣品（未強(qiáng)化）。將空白基質(zhì)樣品在氮?dú)庵懈稍锖螅褂貌煌瑵舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，以建立范圍相當(dāng)于0.075～1μg/kg的6點(diǎn)校準(zhǔn)曲線。

結(jié)果與討論

在分析牛奶提取物之前，調(diào)試氯霉素的最佳源條件，確定ACQUITY QDa檢測器的預(yù)優(yōu)化源參數(shù)可以提供最有效和最靈敏的檢測結(jié)果。氯霉素在15V錐孔電壓的負(fù)離子模式下靈敏度最高。使用上述方法，通過基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線可以對(duì)歐盟MRPL的強(qiáng)化牛奶樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。在0.075～1μg/kg的選定工作范圍內(nèi)，氯霉素具有出色的線性（R2>0.995），如圖1所示。

為了評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，將基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線與相同范圍的溶劑校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。圖2顯示了基質(zhì)匹配和溶劑校準(zhǔn)曲線的疊加圖。從該疊加圖中可以明顯看出基質(zhì)效應(yīng)（離子增強(qiáng)）。通過統(tǒng)計(jì)方法也可以證實(shí)存在基質(zhì)效應(yīng)，利用各校準(zhǔn)曲線的斜率（樣品斜率/標(biāo)準(zhǔn)品斜率X100），計(jì)算出基質(zhì)效應(yīng)為177%。盡管存在基質(zhì)效應(yīng)，使用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線仍然可以對(duì)牛奶中的氯霉素實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量篩查。

對(duì)空白牛奶平行樣品進(jìn)行分析，未檢出假陽性。圖3A顯示了一個(gè)空白提取樣的色譜圖示例，圖中只觀察到基線噪音。對(duì)于歐盟M R PL強(qiáng)化4個(gè)平行牛奶樣品，樣品提取后進(jìn)行重復(fù)分析（不使用價(jià)格昂貴的氘代內(nèi)標(biāo)）（n=8）。對(duì)照基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線對(duì)最終樣品進(jìn)行定量。圖3B顯示了強(qiáng)化濃度（0.3μg/kg）下平行樣的氯霉素峰，峰間信噪比（S/N）≥50，達(dá)到良好水平。

結(jié)論

本文開發(fā)了一種用于定量篩查牛奶中氯霉素的準(zhǔn)確、穩(wěn)定的方法。這種方法經(jīng)證實(shí)可在無內(nèi)標(biāo)的情況下輕松達(dá)到法規(guī)要求的檢測水平，同時(shí)在歐盟MRPL（0.3μg/kg）水平下表現(xiàn)出優(yōu)異的重復(fù)性。質(zhì)譜額外的檢測區(qū)分能力提高了結(jié)果的特異性，未檢出假陽性。endprint

氯霉素是一種價(jià)格廉宜的廣譜抗生素。氯霉素在某些易感個(gè)體中涉及毒性作用。作為致癌物質(zhì)和基因毒性化合物的可疑對(duì)象，氯霉素相關(guān)的再生障礙性貧血（骨髓抑制）致命病例已有廣泛記載。因此，在歐盟、加拿大、美國以及一些亞洲和南美國家均禁止將其用于食用性動(dòng)物、昆蟲和水產(chǎn)養(yǎng)殖。歐盟委員會(huì)指令2003/181/EC規(guī)定，任何用于檢測食品中氯霉素的方法的最小性能限值（MRPL）為0.3μg/kg。

由于產(chǎn)品保質(zhì)期較短，需要快速的處理時(shí)間，因此乳制品檢測實(shí)驗(yàn)室以往都采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)大量樣品進(jìn)行篩查。雖然ELISA可以對(duì)氯霉素進(jìn)行靈敏而快速的篩查，但它的一個(gè)缺點(diǎn)是假陽性結(jié)果很多，據(jù)報(bào)某些案例中的假陽性水平達(dá)到16%。

免疫吸附劑與干擾基質(zhì)之間的交叉反應(yīng)經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致牛奶中氯霉素的誤檢，從而造成不必要的產(chǎn)品銷毀。質(zhì)譜檢測可以提高選擇性，有助于區(qū)分氯霉素和污染基質(zhì)。此外，質(zhì)譜檢測結(jié)合液相色譜（LC）可以避免采用氣相色譜法篩查氯霉素時(shí)所需的費(fèi)時(shí)衍生化處理步驟。為了讓實(shí)驗(yàn)室能夠充分利用這些優(yōu)勢，近期的技術(shù)進(jìn)展著重于提高儀器可用性和穩(wěn)定性。ACQUITY QDa檢測器易于使用，不需要專業(yè)的質(zhì)譜知識(shí)，因而可以方便地整合到LC工作流程中。

應(yīng)用優(yōu)勢

提供了一種牛奶中氯霉素的快速篩查方法。對(duì)檢測結(jié)果低于規(guī)定限值的樣品進(jìn)行定量篩查。

對(duì)管制抗生素進(jìn)行簡單而靈敏的檢測。

將質(zhì)譜檢測簡便應(yīng)用于現(xiàn)有LC工作流程。

實(shí)驗(yàn)

UPLC條件

LC：ACQUITY UPLC I-Class；

運(yùn)行時(shí)間：5min；

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18，1.8μm，2.1×100mm；

流動(dòng)相：10mM醋酸銨的45∶5甲醇/水溶液；

進(jìn)樣體積：10μL。

檢測條件

檢測器：ACQUITY QDa；電離模式：ESI；

SIR通道：m/z 321.0；

錐孔電壓：15V；

探頭溫度：缺省（600℃）；毛細(xì)管電壓：缺?。?.8kV）；采樣速率：缺?。?Hz）。

樣品制備

稱取半脫脂牛奶（5g）樣品，裝入25mL離心管中，強(qiáng)化至濃度達(dá)到0.3μg/kg。通過向樣品中添加己烷（5mL）和70%乙腈溶液（15mL），完成脂肪去除和蛋白質(zhì)沉淀。振搖樣品，然后在3900G（4℃）下離心10min。去除下面的乙腈層（5mL），然后用10%甲醇稀釋至總體積為15mL。

使用甲醇（2mL）和水（4mL）對(duì)Oasis HLB 3cc（60mg）小柱進(jìn)行平衡。將稀釋后的樣品（15mL）加載到小柱上，然后用5%甲醇溶液（6mL）清洗小柱。使用100%甲醇（6mL）洗脫氯霉素。隨后將洗脫液在氮?dú)庵姓舭l(fā)，用10%甲醇溶液（300μL）復(fù)溶后轉(zhuǎn)入LC-MS分析。

標(biāo)準(zhǔn)品制備

采用上述樣品制備方法制備空白牛奶樣品（未強(qiáng)化）。將空白基質(zhì)樣品在氮?dú)庵懈稍锖?，使用不同濃度的?biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，以建立范圍相當(dāng)于0.075～1μg/kg的6點(diǎn)校準(zhǔn)曲線。

結(jié)果與討論

在分析牛奶提取物之前，調(diào)試氯霉素的最佳源條件，確定ACQUITY QDa檢測器的預(yù)優(yōu)化源參數(shù)可以提供最有效和最靈敏的檢測結(jié)果。氯霉素在15V錐孔電壓的負(fù)離子模式下靈敏度最高。使用上述方法，通過基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線可以對(duì)歐盟MRPL的強(qiáng)化牛奶樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。在0.075～1μg/kg的選定工作范圍內(nèi)，氯霉素具有出色的線性（R2>0.995），如圖1所示。

為了評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，將基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線與相同范圍的溶劑校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。圖2顯示了基質(zhì)匹配和溶劑校準(zhǔn)曲線的疊加圖。從該疊加圖中可以明顯看出基質(zhì)效應(yīng)（離子增強(qiáng)）。通過統(tǒng)計(jì)方法也可以證實(shí)存在基質(zhì)效應(yīng)，利用各校準(zhǔn)曲線的斜率（樣品斜率/標(biāo)準(zhǔn)品斜率X100），計(jì)算出基質(zhì)效應(yīng)為177%。盡管存在基質(zhì)效應(yīng)，使用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線仍然可以對(duì)牛奶中的氯霉素實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量篩查。

對(duì)空白牛奶平行樣品進(jìn)行分析，未檢出假陽性。圖3A顯示了一個(gè)空白提取樣的色譜圖示例，圖中只觀察到基線噪音。對(duì)于歐盟M R PL強(qiáng)化4個(gè)平行牛奶樣品，樣品提取后進(jìn)行重復(fù)分析（不使用價(jià)格昂貴的氘代內(nèi)標(biāo)）（n=8）。對(duì)照基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線對(duì)最終樣品進(jìn)行定量。圖3B顯示了強(qiáng)化濃度（0.3μg/kg）下平行樣的氯霉素峰，峰間信噪比（S/N）≥50，達(dá)到良好水平。

結(jié)論

本文開發(fā)了一種用于定量篩查牛奶中氯霉素的準(zhǔn)確、穩(wěn)定的方法。這種方法經(jīng)證實(shí)可在無內(nèi)標(biāo)的情況下輕松達(dá)到法規(guī)要求的檢測水平，同時(shí)在歐盟MRPL（0.3μg/kg）水平下表現(xiàn)出優(yōu)異的重復(fù)性。質(zhì)譜額外的檢測區(qū)分能力提高了結(jié)果的特異性，未檢出假陽性。endprint