HPLC法同時(shí)測(cè)定遍地金中4種黃酮類成分的含量

邱海洋等

摘要：建立同時(shí)測(cè)定遍地金（Hypericum wightianum）藥材中槲皮素、槲皮苷、木犀草素、山奈酚含量的高效液相色譜分析方法。采用Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，柱溫30 ℃，槲皮素、槲皮苷、木犀草素、山奈酚線性范圍分別為0.078～2.340 μg、0.106～3.180 μg、0.04～1.200 μg、0.062～1.860 μg；遍地金中槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分別為0.385%、0.022%、0.012%和0.111%，該方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確實(shí)用。

關(guān)鍵詞：遍地金（Hypericum wightianum）；高效液相色譜法；槲皮素；槲皮苷；木犀草素；山奈酚

中圖分類號(hào)：O657.32； 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）16-3898-03

Abstract：To simultaneously determine the contents of quercitrin，quercetin，luteolin and kaempferol in harb Hypericum wightianum， the samples were separated on the column of Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） eluted with methanol and water（0.04% phosphoric acid）. The sample size was 10 μL. The wavelength uesd was 360 nm and column temperature was 30℃. The linear ranges of quercitrin， quercetin ，luteolin and kaempferol were 0.078-2.340 μg，0.106-3.180 μg， 0.040-1.200 μg and 0.062-1.860 μg， respectively. The contents of four flavonoids from seven different areas in Qinghai province and different organs were 0.385%，0.022%，0.012% and 0.111%. The method was rapid and accurate.

Key words：Hypericum wightianum；HPLC；quercitrin；quercetin； luteolin；kaempferol

金絲桃屬植物在抗抑郁、抑制中樞神經(jīng)、抗腫瘤和抗病毒[1-3]方面的突出作用， 使得該屬植物的研究受到國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注[4]。遍地金（Hypericum wightianum）為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，分布于云南、四川、貴州、西藏等地，有收斂止血、清熱解毒的功效，民間用于治療小兒炎癥、久痢、久瀉、毒蛇咬傷等疾病[5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，該植物具有明顯的抗抑郁作用[6]，該作用不僅與金絲桃素含量有關(guān)，還與植物中所含其他成分相關(guān)[7]。已有對(duì)該植物化學(xué)成分及分析方法的報(bào)道[8]，但未見(jiàn)對(duì)該植物中槲皮素、槲皮苷、木犀草素、山奈酚含量同時(shí)測(cè)定的報(bào)道。試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定上述4種成分含量的HPLC方法，為該資源后續(xù)開(kāi)發(fā)利用及為新藥源研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 遍地金：2011年采自西藏林芝地區(qū)，陰干后粉碎備用。所用標(biāo)準(zhǔn)品槲皮苷（批號(hào)：111538-200403）、槲皮素（批號(hào)：100081-200406）、木犀草素（批號(hào)：111520-200201）、山奈酚（批號(hào)：110861-200707）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。色譜純甲醇為高效液相色譜專用試劑（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠）；水為娃哈哈純凈水；磷酸為AR級(jí)（天津市紅巖試劑廠）。

1.1.2 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）、AG204型電子分析天平（南京安鐸貿(mào)易有限責(zé)任公司）、SHB—Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（上?？婆d儀器有限公司）、EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱。流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%的磷酸水（B），流動(dòng)相在30 min內(nèi)甲醇由35%線性增加至65%。流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 樣品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過(guò)夜的槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品適量，用色譜純甲醇分別配置成0.78、1.06、0.40、0.62 mg/mL的儲(chǔ)備液。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取地黃金粉末1.014 g，置于三角瓶中，精密加入20 mL甲醇，密封室溫下浸泡2 h，超聲波處理2 h，冷卻至室溫，稱重，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，移至25 mL容量瓶甲醇定容，測(cè)加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖結(jié)果

對(duì)照品和樣品色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚保留時(shí)間分別為15.1、22.1、27.1 min和28.2 min，遍地金中的槲皮素和山奈酚含量較高，槲皮苷和木犀草素較低。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋10倍后在選定的色譜條件下分別進(jìn)樣1、5、10、15、20、30 μL，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)做一元線性回歸，4種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=1 807X-41.85、Y=3 309X-18.23、Y=2 363X-19.09、Y=3 246X-7.84，線性范圍分別為：0.078～2.34 μg、0.106～3.18 μg、0.04～1.2 μg、0.062～1.86 μg，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6、0.999 7、0.999 7、0.999 8。endprint

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

量取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，在選定的色譜條件下測(cè)定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.97%、0.91%、1.1%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

樣品溶液在選定的色譜條件下進(jìn)樣10 μL，重復(fù)測(cè)定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.6%，1.7%，1.2%，1.6%，表明重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

取“1.2.3”中樣品溶液，分別放置0、2、4、6、12 h后在“1.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.6%、1.4%、1.4%、1.7%，表明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取遍地金粉末0.5 g共3份，分別添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液：槲皮苷（0.78 mg/mL）2.28 mL、槲皮素（1.06 mg/mL）溶液0.11 mL、木犀草素（0.40 mg/mL）溶液0.15 mL、山奈酚（0.62 mg/mL）0.90 mL，按“1.2.3”操作，測(cè)得加標(biāo)回收率分別為槲皮苷99.6%、槲皮素96.4%、木犀草素98.6%、山奈酚102.7%，說(shuō)明準(zhǔn)確程度良好。

2.7 樣品測(cè)定

按選定的色譜條件測(cè)定遍地金樣品中4種黃酮類成分的含量，進(jìn)樣量10 μL，以外標(biāo)法定量，測(cè)得槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分別為0.385%、0.022%、0.012%和0.111%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法測(cè)定遍地金中4種黃酮類成分槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分別為0.385%、0.022%、0.012%和0.111%，該方法具有操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)該資源的評(píng)價(jià)、開(kāi)發(fā)利用以及新藥源研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

試驗(yàn)前期比較了甲醇、乙醇、水等不同溶液作為提取劑，結(jié)果以甲醇提取的黃酮含量較高，色譜峰形較佳，分離效果較好?？紤]超聲波提取方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，所以選擇超聲波提取法，而沒(méi)有選擇熱回流法。試驗(yàn)所測(cè)的4種黃酮成分在260 nm和360 nm處均有較大吸收，但260 nm處干擾較大，故選擇360 nm做檢測(cè)波長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LINDE K， RAMIREZ H， MULROW C D， et al. St Johns'wort for depression-an overview and meta-analysis of randomised clinicaltrials [J]. BMJ， 1996， 313（7052） ： 253-258.

[2] 潘映紅，郭寶林，彭 勇.國(guó)產(chǎn)金絲桃屬藥用植物資源現(xiàn)狀及利用前景[J].中藥材，1993，16（3）：14-18.

[3] 江蘇省植物研究所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.新華本草綱要[M].第一冊(cè).上海：上?？萍汲霭嫔?，1988.216-217.

[4] 石金城，孫興華，劉 媛，等.遍地金不同提取物的抗抑郁作用[J].華西藥學(xué)雜志，2012，27（2）：128-131.

[5] 趙 晶，何洪靜，高 瑋，等.遍地金提取物對(duì)大鼠腦突觸體[3H]-去甲腎上腺素再攝取抑制作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（7）：400-402.

[6] 陶曙紅，吳鳳鍔.遍地金的化學(xué)成分研究Ⅱ[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2004，16（1）：26-27.

[7] 陶曙紅，吳鳳鍔.遍地金的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2004，35（2）：136-137.

[8] 鄭清明，秦路平，鄭漢臣，等.國(guó)產(chǎn)11種金絲桃屬植物中化學(xué)成分的含量分析[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（4）：457-459.

（責(zé)任編輯 龍小玲）endprint

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

量取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，在選定的色譜條件下測(cè)定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.97%、0.91%、1.1%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

樣品溶液在選定的色譜條件下進(jìn)樣10 μL，重復(fù)測(cè)定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.6%，1.7%，1.2%，1.6%，表明重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

取“1.2.3”中樣品溶液，分別放置0、2、4、6、12 h后在“1.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.6%、1.4%、1.4%、1.7%，表明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取遍地金粉末0.5 g共3份，分別添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液：槲皮苷（0.78 mg/mL）2.28 mL、槲皮素（1.06 mg/mL）溶液0.11 mL、木犀草素（0.40 mg/mL）溶液0.15 mL、山奈酚（0.62 mg/mL）0.90 mL，按“1.2.3”操作，測(cè)得加標(biāo)回收率分別為槲皮苷99.6%、槲皮素96.4%、木犀草素98.6%、山奈酚102.7%，說(shuō)明準(zhǔn)確程度良好。

2.7 樣品測(cè)定

按選定的色譜條件測(cè)定遍地金樣品中4種黃酮類成分的含量，進(jìn)樣量10 μL，以外標(biāo)法定量，測(cè)得槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分別為0.385%、0.022%、0.012%和0.111%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法測(cè)定遍地金中4種黃酮類成分槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分別為0.385%、0.022%、0.012%和0.111%，該方法具有操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)該資源的評(píng)價(jià)、開(kāi)發(fā)利用以及新藥源研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

試驗(yàn)前期比較了甲醇、乙醇、水等不同溶液作為提取劑，結(jié)果以甲醇提取的黃酮含量較高，色譜峰形較佳，分離效果較好。考慮超聲波提取方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，所以選擇超聲波提取法，而沒(méi)有選擇熱回流法。試驗(yàn)所測(cè)的4種黃酮成分在260 nm和360 nm處均有較大吸收，但260 nm處干擾較大，故選擇360 nm做檢測(cè)波長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LINDE K， RAMIREZ H， MULROW C D， et al. St Johns'wort for depression-an overview and meta-analysis of randomised clinicaltrials [J]. BMJ， 1996， 313（7052） ： 253-258.

[2] 潘映紅，郭寶林，彭 勇.國(guó)產(chǎn)金絲桃屬藥用植物資源現(xiàn)狀及利用前景[J].中藥材，1993，16（3）：14-18.

[3] 江蘇省植物研究所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.新華本草綱要[M].第一冊(cè).上海：上海科技出版社，1988.216-217.

[4] 石金城，孫興華，劉 媛，等.遍地金不同提取物的抗抑郁作用[J].華西藥學(xué)雜志，2012，27（2）：128-131.

[5] 趙 晶，何洪靜，高 瑋，等.遍地金提取物對(duì)大鼠腦突觸體[3H]-去甲腎上腺素再攝取抑制作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（7）：400-402.

[6] 陶曙紅，吳鳳鍔.遍地金的化學(xué)成分研究Ⅱ[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2004，16（1）：26-27.

[7] 陶曙紅，吳鳳鍔.遍地金的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2004，35（2）：136-137.

[8] 鄭清明，秦路平，鄭漢臣，等.國(guó)產(chǎn)11種金絲桃屬植物中化學(xué)成分的含量分析[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（4）：457-459.

（責(zé)任編輯 龍小玲）endprint

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

量取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，在選定的色譜條件下測(cè)定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.97%、0.91%、1.1%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

樣品溶液在選定的色譜條件下進(jìn)樣10 μL，重復(fù)測(cè)定5次，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.6%，1.7%，1.2%，1.6%，表明重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

取“1.2.3”中樣品溶液，分別放置0、2、4、6、12 h后在“1.2.1”色譜條件下進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，得到槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.6%、1.4%、1.4%、1.7%，表明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取遍地金粉末0.5 g共3份，分別添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液：槲皮苷（0.78 mg/mL）2.28 mL、槲皮素（1.06 mg/mL）溶液0.11 mL、木犀草素（0.40 mg/mL）溶液0.15 mL、山奈酚（0.62 mg/mL）0.90 mL，按“1.2.3”操作，測(cè)得加標(biāo)回收率分別為槲皮苷99.6%、槲皮素96.4%、木犀草素98.6%、山奈酚102.7%，說(shuō)明準(zhǔn)確程度良好。

2.7 樣品測(cè)定

按選定的色譜條件測(cè)定遍地金樣品中4種黃酮類成分的含量，進(jìn)樣量10 μL，以外標(biāo)法定量，測(cè)得槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分別為0.385%、0.022%、0.012%和0.111%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法測(cè)定遍地金中4種黃酮類成分槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量分別為0.385%、0.022%、0.012%和0.111%，該方法具有操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)該資源的評(píng)價(jià)、開(kāi)發(fā)利用以及新藥源研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

試驗(yàn)前期比較了甲醇、乙醇、水等不同溶液作為提取劑，結(jié)果以甲醇提取的黃酮含量較高，色譜峰形較佳，分離效果較好?？紤]超聲波提取方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，所以選擇超聲波提取法，而沒(méi)有選擇熱回流法。試驗(yàn)所測(cè)的4種黃酮成分在260 nm和360 nm處均有較大吸收，但260 nm處干擾較大，故選擇360 nm做檢測(cè)波長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LINDE K， RAMIREZ H， MULROW C D， et al. St Johns'wort for depression-an overview and meta-analysis of randomised clinicaltrials [J]. BMJ， 1996， 313（7052） ： 253-258.

[2] 潘映紅，郭寶林，彭 勇.國(guó)產(chǎn)金絲桃屬藥用植物資源現(xiàn)狀及利用前景[J].中藥材，1993，16（3）：14-18.

[3] 江蘇省植物研究所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.新華本草綱要[M].第一冊(cè).上海：上?？萍汲霭嫔?，1988.216-217.

[4] 石金城，孫興華，劉 媛，等.遍地金不同提取物的抗抑郁作用[J].華西藥學(xué)雜志，2012，27（2）：128-131.

[5] 趙 晶，何洪靜，高 瑋，等.遍地金提取物對(duì)大鼠腦突觸體[3H]-去甲腎上腺素再攝取抑制作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（7）：400-402.

[6] 陶曙紅，吳鳳鍔.遍地金的化學(xué)成分研究Ⅱ[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2004，16（1）：26-27.

[7] 陶曙紅，吳鳳鍔.遍地金的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2004，35（2）：136-137.

[8] 鄭清明，秦路平，鄭漢臣，等.國(guó)產(chǎn)11種金絲桃屬植物中化學(xué)成分的含量分析[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（4）：457-459.

（責(zé)任編輯 龍小玲）endprint