高溫脅迫下2，4—表油菜素內(nèi)酯對浙貝母花期耐熱性及光合特性的影響

陸兵等

摘要：在盆栽條件下，以狹葉浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）為材料，研究了浙貝母花期高溫脅迫條件下表油菜素內(nèi)酯（EBR）對浙貝母耐熱性和光合特性的影響。結(jié)果表明，0.10、0.50 mg/L EBR能明顯提高葉片中可溶性蛋白含量、SOD、POD和CAT活性，降低MDA含量，增強其抗氧化能力，緩解高溫脅迫導致的膜質(zhì)過氧化傷害；同時，EBR提高了葉片葉綠素含量、Pn、Gs和Tr，從而提高了高溫脅迫下浙貝母植株的光合作用；然而EBR并不能提高其Pro及可溶性糖含量，對葉片中類胡蘿卜素及胞間CO2濃度（Ci）影響差異不大。結(jié)果表明，EBR通過提高高溫脅迫下浙貝母葉片可溶性蛋白及葉綠素含量、抗氧化酶活性，來降低體內(nèi)活性氧水平，維持較高的光合速率，以0.50 mg/L EBR效果最好。

關(guān)鍵詞：高溫脅迫；2，4-表油菜素內(nèi)酯；浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）；耐熱性；光合特性

中圖分類號：S567.23+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3845-04

Abstract：The effects of epibrassionlide on thermotolerance and photosynthesis in leaves of F. thunbergii（xiaye） grown in pots were investigated under high temperature. The results showed that the treatment of 0.10，0.50 mg/L-1 2.4-epibrassionlide could effectively enhance antioxidation ability and alleviate injury of membrane lipid peroxidation caused by high temperature through increasing content of soluble protein， activities of superoxide dismutase（SOD），peroxidase （POD） and catalase（CAT），and decreasing malondialdehyde（MDA） content. EBR pretreatment improved the photosynthesis in F. thunbergii（xiaye）leaves by increasing the chlorophyll content， net photosynthetic rate（Pn），stomatal conductance（Gs），ranspiration rate（Tr）. EBR pretreatment couldnt increase contents of proline and soluble sugar， and had little effect on carotenoid content and intercellular CO2 concentration（Ci） in leaves. It is indicated that EBR pretreatment could suppress reactive oxygen levels， keep higher photosynthetic rate by increasing contents of soluble protein and chlorophyll， activities of antioxidant enzymes. The better alleviating effect on high temperature damage was 0.50 mg/L EBR.

Key words：high temperature stress；2，4-Epibrassinolide； Fritillaria thunbergii Miq.；thermotolerance； photosynthesis

浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）是中國五大類貝母中最主要的貴重藥材，被列為“浙八味”之首，歷版《中國藥典》均有收載。浙貝母喜溫涼的氣候條件，平均氣溫在17 ℃左右時，地上部莖葉生長迅速，氣溫高到30 ℃時，浙貝母生長受到抑制，造成植株枯萎倒苗。在浙貝母大田生產(chǎn)中，初夏高溫（30 ℃）將嚴重影響浙貝母的生長期長短[1]。因此，提高浙貝母的耐熱性是生產(chǎn)中一個急需解決的問題。

油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BR）是植物正常生長和發(fā)育所必需的，在植物體內(nèi)含量極低，但生理活性極高，目前已被公認為一類新型的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，被稱為第六大類植物激素。人工合成的高活性油菜素內(nèi)酯類似物為表油菜素內(nèi)酯（EBR）。研究表明，BR不僅能影響植物的生長發(fā)育，例如能增強細胞的分裂和伸長、提高光合速率、促進光合作用、促進生長等，而且也參與植物的逆境反應[2]。張永平等[3]用1.0 mg/L的EBR溶液處理甜瓜幼苗，能明顯促進高溫脅迫下甜瓜幼苗的生長，提高保護酶活性，增強植株抗氧化能力，促進脯氨酸和可溶性蛋白含量升高，丙二醛（MDA）含量下降，能有效緩解高溫脅迫引起的膜脂過氧化傷害；同時能減輕高溫脅迫對光合作用的抑制作用。本試驗以浙貝母為材料，研究葉面噴施不同濃度的EBR對高溫脅迫下浙貝母抗熱性相關(guān)生理指標及光合作用的影響，旨在為EBR在提高浙貝母耐熱性方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2012年9月至次年3月在南通農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院溫室大棚內(nèi)進行。浙貝母采自于浙江省鄞州區(qū)。選擇完好的鱗莖進行盆栽，盆高20 cm，直徑20 cm，基質(zhì)為均勻一致的輕黏壤土，每盆播種4個鱗莖，播種深度5～6 cm，置于溫室大棚內(nèi)，管理措施一致。從次年3月11日起于每天8：00分別噴施0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L的表油菜素內(nèi)酯，以噴施清水為對照，葉片正反面均進行噴施，至布滿液珠而不滴為度。連續(xù)噴施4 d后，將浙貝母苗移至光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器制造廠生產(chǎn)）內(nèi)，溫度為30 ℃/25 ℃（晝/夜）、光照度3 600 lx、光周期12 h/12 h （晝/夜），進行高溫脅迫處理。處理3 d后，將浙貝母轉(zhuǎn)移至自然光照條件下取樣進行相關(guān)指標測定。為了避免水分脅迫，高溫處理期間保持土壤濕潤，培養(yǎng)箱內(nèi)相對濕度保持在70%～80%。

1.2 測定項目與方法

葉綠素（Chl）含量采用浸提法[4]；采用LI-6400便攜式光合儀對葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）及蒸騰速率（Tr）進行測定。

可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定；脯氨酸（Pro）含量測定采用酸性茚三酮比色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用NBT光還原法測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法測定；丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法[5]測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR對高溫脅迫下浙貝母光合特性的影響

2.1.1 EBR對高溫脅迫下浙貝母光和色素含量的影響 由表1可知，EBR處理后，浙貝母在高溫脅迫后葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均有明顯增加，在0.01～0.50 mg/L EBR范圍內(nèi)，三者與EBR濃度呈正相關(guān)。1.00 mg/L EBR下，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量雖較對照增加了17.02%、24.73%和18.91%，差異顯著，但與0.50 mg/L相比，三者含量均有所下降。而各濃度EBR浙貝母在高溫脅迫后，其類胡蘿卜素含量與對照均無顯著差異。

2.1.2 EBR對高溫脅迫下浙貝母光和指標的影響 由表2可知，EBR能顯著提高高溫脅迫后浙貝母葉片的Pn，隨著EBR濃度的增加Pn先升高后降低，在0.50 mg/L時，Pn達到最高，較對照增加了175.83%。EBR在增加Pn的同時，也提高了浙貝母葉片的Gs和Tr，在0.50 mg/L時，兩者同樣達到最高，較對照分別增加了179.41%和220.49%。在各濃度EBR下，浙貝母葉片Ci與對照相比均無顯著差異。

2.2 EBR對高溫脅迫下浙貝母葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由表3可知，EBR對高溫脅迫后浙貝母葉片脯氨酸的含量有明顯影響。除EBR濃度為0.01 mg/L時，脯氨酸含量較對照高外，其他處理均低于對照，且隨著EBR濃度的升高，脯氨酸含量表現(xiàn)出先降后升的趨勢。在EBR濃度為0.10和0.50 mg/L時，葉片脯氨酸含量顯著低于對照，其他3個濃度處理較對照低，但并無顯著差異。

經(jīng)EBR處理，高溫脅迫后浙貝母葉片可溶性蛋白的含量與脯氨酸相比表現(xiàn)出相反的趨勢，即可溶性蛋白含量隨著EBR濃度的升高先上升后下降，且均高于對照。0.50 mg/L EBR處理的浙貝母葉片可溶性蛋白含量最高，比對照高出41.55%，之后下降。

在高溫脅迫后，經(jīng)EBR處理的浙貝母葉片可溶性糖含量均低于對照，0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L EBR處理分別比對照下降了29.59%、9.59%、22.99%、1.52%和14.77%，其中0.05、0.50 mg/L EBR處理與對照無顯著差異，其他處理則顯著低于對照。

2.3 EBR對高溫脅迫下浙貝母抗氧化代謝的影響

由表4可知，EBR處理對浙貝母葉片SOD、POD及CAT的活性和MDA的含量具有顯著影響，隨著EBR濃度的升高，3種酶活性均呈先升高后下降的趨勢，而MDA含量表現(xiàn)出相反的趨勢，表明EBR對浙貝母幼苗上述3種酶活性及MDA含量的影響具有劑量效應。

與對照相比，EBR在0.01～1.00 mg/L的濃度范圍內(nèi)，均能提高浙貝母葉片SOD活性，其中EBR濃度為0.01 mg/L時SOD活性差異不顯著，其余處理差異顯著，且在0.50 mg/L時達到最大值，較對照上升了164.25%，隨之EBR處理對SOD活性的提高作用減弱。

與對照相比，0.01～0.50 mg/L的EBR處理均能提高浙貝母葉片POD活性，其中以0.50 mg/L處理活性最高，且差異顯著；當EBR處理濃度為1.00 mg/L時，POD活性反而較對照下降了5.48%。

不同濃度EBR顯著提高了浙貝母葉片CAT活性，在EBR濃度為0.50 mg/L時達到最大值，各處理下CAT活性較對照分別升高了40.88%、74.91%、101.05%、144.44%和24.66%，差異顯著。

經(jīng)過EBR處理的浙貝母在高溫脅迫3 d后葉片MDA含量較對照均有不同程度的下降，且具有顯著差異，隨EBR濃度的增加，其含量表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。0.50 mg/L EBR處理下的MDA含量達到最低，與對照相比下降了36.33%，EBR濃度為1.00 mg/L時，MDA含量上升，但仍較對照低。

3 討論

正常環(huán)境下生長的植物體內(nèi)，活性氧產(chǎn)生與淬滅處于動態(tài)平衡，而高溫脅迫嚴重影響植物生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，導致活性氧代謝失衡，細胞內(nèi)活性氧大量積累而使細胞受到了氧脅迫，同時，高溫脅迫下光合作用普遍受到抑制[6]。浙貝母生長期較短，高溫脅迫是其主要限制因素之一。

許多研究證明，BR能通過提高細胞保護酶活性和光合作用、促進脯氨酸累積及改善細胞膜透性等方面來提高植物的抗逆性（抗旱性、抗冷抗寒性、抗熱性、抗鹽性、抗藥性、抗毒性）[7]。

3.1 EBR對高溫脅迫下浙貝母光合特性的影響

光合作用是植物對于高溫脅迫最為敏感的生理反應之一，往往在其他的高溫誘導傷害癥狀出現(xiàn)之前就已因高溫受到抑制[8]。高溫抑制植物的光合作用，導致光合速率下降可能是氣孔因素，也可能是非氣孔因素引起的。Farquhar等[9]認為，如果Gs下降，而Ci維持不變甚至上升，則光合速率的下降應是由葉肉細胞同化能力降低等非氣孔因素所致；只有Ci和Gs同時下降，才能表明光合速率的下降主要是由氣孔因素引起的。區(qū)分影響光合作用的氣孔和非氣孔因素有利于理解EBR促進光合作用的作用位點。

本研究結(jié)果表明，高溫脅迫后，各EBR處理下的浙貝母葉片Gs均較對照高，但Ci并無顯著差異，因此，EBR并不是通過降低氣孔限制來提高Pn，這與張永平等[10]用EBR處理提高高溫脅迫后甜瓜葉片凈光合速率的結(jié)果一致。而Tr的升高說明EBR能通過提高浙貝母高溫脅迫下的蒸騰速率來調(diào)節(jié)體溫和礦質(zhì)鹽的運轉(zhuǎn)，從而減輕高溫傷害。葉綠素含量是影響光合作用光能吸收的重要因子，0.05～1.0 mg/L EBR均能顯著提高浙貝母葉綠素含量，這與阮英慧[11]的研究結(jié)果類似。據(jù)此推測，EBR可能通過促進光合機構(gòu)對CO2的利用能力及提高高溫脅迫后浙貝母葉片的葉綠素含量來提高光合作用。

3.2 EBR對高溫脅迫下浙貝母葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

滲透調(diào)節(jié)是抵抗逆境脅迫的一種重要方式，游離Pro、可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)3種主要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在高溫環(huán)境下，植物主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，抵抗熱脅迫的傷害[12]。植物體中高的Pro含量具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力及保護細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，與細胞內(nèi)的一些化合物形成類似親水膠體的聚合物，有一定的保水作用[13]?？扇苄缘鞍缀康奶岣呖梢栽黾蛹毎臐B透勢和功能蛋白（如熱激蛋白）的數(shù)量，有助于維持細胞正常的代謝，提高植物的抗逆性[14]。逆境脅迫下，植物細胞中積累的可溶性糖參與滲透保護、滲透調(diào)節(jié)、碳的儲藏以及活性氧的清除[15]。研究表明，用EBR分別處理高溫脅迫下的黃瓜（48 ℃）和甜瓜（42 ℃）幼苗，能顯著增加幼苗體內(nèi)的可溶性蛋白和脯氨酸含量[10，16]。

本研究結(jié)果表明，高溫脅迫后，經(jīng)0.50 mg/L EBR處理的浙貝母葉片的可溶性蛋白含量顯著高于對照，但各濃度EBR并不能顯著提高其脯氨酸和可溶性糖的含量，與對照相比，其含量甚至較低，這與王炳奎[17]關(guān)于表油菜素內(nèi)酯對水稻幼苗抗冷性的影響研究中脯氨酸的變化類似。因此，本研究認為EBR并不能通過增加浙貝母葉片滲透性物質(zhì)的積累來提高其滲透調(diào)節(jié)能力，進而提高其耐熱性。另外研究表明，植物耐熱性的產(chǎn)生與熱激蛋白的合成有關(guān)[18]。本研究中浙貝母可溶性蛋白含量增加的原因可能是由于高溫脅迫下EBR能促進浙貝母合成更多的熱激蛋白，使植物耐熱性增強，但也不排除EBR降低了蛋白質(zhì)降解速率及難溶性蛋白變成可溶的可能。

3.3 EBR對高溫脅迫下浙貝母抗氧化代謝的影響

高溫脅迫會使植株活性氧生成增加，膜質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，損傷生物膜系統(tǒng)，使細胞受到氧化脅迫?？寡趸富钚耘c植物活性氧代謝直接相關(guān)，其活性水平間接地反映了植物抗高溫脅迫的能力[6]。SOD、CAT、POD是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個重要保護酶，SOD能催化植株體內(nèi)的歧化反應，使■轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，H2O2再通過CAT和POD分解成沒有毒害的H2O和O2，它們對植物體內(nèi)活性氧的清除起重要作用[19]。萬正林等[20]報道0.50 mg/L EBR誘導番茄幼苗耐熱性的作用機理在于噴施處理EBR后，在高溫脅迫條件下能夠維持番茄幼苗較高的抗氧化酶活性，減少膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，從而保護細胞膜的熱穩(wěn)定性，提高其抗高溫能力。

本試驗結(jié)果表明，在0.5 mg/L EBR下，高溫脅迫后浙貝母葉片SOD、POD和CAT活性較對照顯著增加，MDA含量顯著減少，這說明EBR可以明顯提高浙貝母的耐熱性。

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3.2 EBR對高溫脅迫下浙貝母葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

滲透調(diào)節(jié)是抵抗逆境脅迫的一種重要方式，游離Pro、可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)3種主要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在高溫環(huán)境下，植物主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，抵抗熱脅迫的傷害[12]。植物體中高的Pro含量具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力及保護細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，與細胞內(nèi)的一些化合物形成類似親水膠體的聚合物，有一定的保水作用[13]?？扇苄缘鞍缀康奶岣呖梢栽黾蛹毎臐B透勢和功能蛋白（如熱激蛋白）的數(shù)量，有助于維持細胞正常的代謝，提高植物的抗逆性[14]。逆境脅迫下，植物細胞中積累的可溶性糖參與滲透保護、滲透調(diào)節(jié)、碳的儲藏以及活性氧的清除[15]。研究表明，用EBR分別處理高溫脅迫下的黃瓜（48 ℃）和甜瓜（42 ℃）幼苗，能顯著增加幼苗體內(nèi)的可溶性蛋白和脯氨酸含量[10，16]。

本研究結(jié)果表明，高溫脅迫后，經(jīng)0.50 mg/L EBR處理的浙貝母葉片的可溶性蛋白含量顯著高于對照，但各濃度EBR并不能顯著提高其脯氨酸和可溶性糖的含量，與對照相比，其含量甚至較低，這與王炳奎[17]關(guān)于表油菜素內(nèi)酯對水稻幼苗抗冷性的影響研究中脯氨酸的變化類似。因此，本研究認為EBR并不能通過增加浙貝母葉片滲透性物質(zhì)的積累來提高其滲透調(diào)節(jié)能力，進而提高其耐熱性。另外研究表明，植物耐熱性的產(chǎn)生與熱激蛋白的合成有關(guān)[18]。本研究中浙貝母可溶性蛋白含量增加的原因可能是由于高溫脅迫下EBR能促進浙貝母合成更多的熱激蛋白，使植物耐熱性增強，但也不排除EBR降低了蛋白質(zhì)降解速率及難溶性蛋白變成可溶的可能。

3.3 EBR對高溫脅迫下浙貝母抗氧化代謝的影響

高溫脅迫會使植株活性氧生成增加，膜質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，損傷生物膜系統(tǒng)，使細胞受到氧化脅迫?？寡趸富钚耘c植物活性氧代謝直接相關(guān)，其活性水平間接地反映了植物抗高溫脅迫的能力[6]。SOD、CAT、POD是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個重要保護酶，SOD能催化植株體內(nèi)的歧化反應，使■轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，H2O2再通過CAT和POD分解成沒有毒害的H2O和O2，它們對植物體內(nèi)活性氧的清除起重要作用[19]。萬正林等[20]報道0.50 mg/L EBR誘導番茄幼苗耐熱性的作用機理在于噴施處理EBR后，在高溫脅迫條件下能夠維持番茄幼苗較高的抗氧化酶活性，減少膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，從而保護細胞膜的熱穩(wěn)定性，提高其抗高溫能力。

本試驗結(jié)果表明，在0.5 mg/L EBR下，高溫脅迫后浙貝母葉片SOD、POD和CAT活性較對照顯著增加，MDA含量顯著減少，這說明EBR可以明顯提高浙貝母的耐熱性。

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3.2 EBR對高溫脅迫下浙貝母葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

滲透調(diào)節(jié)是抵抗逆境脅迫的一種重要方式，游離Pro、可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)3種主要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在高溫環(huán)境下，植物主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，抵抗熱脅迫的傷害[12]。植物體中高的Pro含量具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力及保護細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，與細胞內(nèi)的一些化合物形成類似親水膠體的聚合物，有一定的保水作用[13]?？扇苄缘鞍缀康奶岣呖梢栽黾蛹毎臐B透勢和功能蛋白（如熱激蛋白）的數(shù)量，有助于維持細胞正常的代謝，提高植物的抗逆性[14]。逆境脅迫下，植物細胞中積累的可溶性糖參與滲透保護、滲透調(diào)節(jié)、碳的儲藏以及活性氧的清除[15]。研究表明，用EBR分別處理高溫脅迫下的黃瓜（48 ℃）和甜瓜（42 ℃）幼苗，能顯著增加幼苗體內(nèi)的可溶性蛋白和脯氨酸含量[10，16]。

本研究結(jié)果表明，高溫脅迫后，經(jīng)0.50 mg/L EBR處理的浙貝母葉片的可溶性蛋白含量顯著高于對照，但各濃度EBR并不能顯著提高其脯氨酸和可溶性糖的含量，與對照相比，其含量甚至較低，這與王炳奎[17]關(guān)于表油菜素內(nèi)酯對水稻幼苗抗冷性的影響研究中脯氨酸的變化類似。因此，本研究認為EBR并不能通過增加浙貝母葉片滲透性物質(zhì)的積累來提高其滲透調(diào)節(jié)能力，進而提高其耐熱性。另外研究表明，植物耐熱性的產(chǎn)生與熱激蛋白的合成有關(guān)[18]。本研究中浙貝母可溶性蛋白含量增加的原因可能是由于高溫脅迫下EBR能促進浙貝母合成更多的熱激蛋白，使植物耐熱性增強，但也不排除EBR降低了蛋白質(zhì)降解速率及難溶性蛋白變成可溶的可能。

3.3 EBR對高溫脅迫下浙貝母抗氧化代謝的影響

高溫脅迫會使植株活性氧生成增加，膜質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，損傷生物膜系統(tǒng)，使細胞受到氧化脅迫?？寡趸富钚耘c植物活性氧代謝直接相關(guān)，其活性水平間接地反映了植物抗高溫脅迫的能力[6]。SOD、CAT、POD是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個重要保護酶，SOD能催化植株體內(nèi)的歧化反應，使■轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，H2O2再通過CAT和POD分解成沒有毒害的H2O和O2，它們對植物體內(nèi)活性氧的清除起重要作用[19]。萬正林等[20]報道0.50 mg/L EBR誘導番茄幼苗耐熱性的作用機理在于噴施處理EBR后，在高溫脅迫條件下能夠維持番茄幼苗較高的抗氧化酶活性，減少膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，從而保護細胞膜的熱穩(wěn)定性，提高其抗高溫能力。

本試驗結(jié)果表明，在0.5 mg/L EBR下，高溫脅迫后浙貝母葉片SOD、POD和CAT活性較對照顯著增加，MDA含量顯著減少，這說明EBR可以明顯提高浙貝母的耐熱性。

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