一株拮抗腐霉病菌的枯草芽孢桿菌的分離鑒定及誘變選育

司賀龍等

摘要：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可產(chǎn)生多種抗菌蛋白、抗生素及酶類(lèi)抗菌物質(zhì)，對(duì)多種植物病原真菌有良好的防治效果。通過(guò)從土壤中分離抑真菌活性的枯草芽孢桿菌，并進(jìn)行UV-NaNO2物理化學(xué)聯(lián)合誘變，獲得一株對(duì)腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株。突變菌株的生長(zhǎng)速率、耐高溫性均較出發(fā)菌株有較大提高，盆栽試驗(yàn)表明誘變菌株較出發(fā)菌株對(duì)腐霉病菌引發(fā)的黃瓜腐霉病具有更好的防治作用。

關(guān)鍵詞：拮抗細(xì)菌；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；UV-NaNO2復(fù)合誘變；腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）

中圖分類(lèi)號(hào)：S476.1；Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）16-3805-04

Abstract： Bacillus subtilis can produce a variety of antibacterial protein， antibiotics and antibacterial substances，which have fine control efficiency for plant pathogenic fungi. An antagonistic bacterium strain was obtained by isolating the antifungal activity from the soil and UV-NaNO2 combination mutagenesis. A strain with strong antagonism to Pythium aphanidermatum was obtained. The growth rate and heat resistance was highly improved than those of the original strain. The result showed that the strain had better controling effect against Pythium aphanidermatum.

Key words： plant pathogenic fungi； Bacillus subtilis；UV- NaNO2 mutagenesis； Pythium aphanidermatum

隨著化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用，環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留的弊端日益凸顯，生物防治植物病害成為目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科研中的重要內(nèi)容之一。植物病原微生物和環(huán)境微生物之間的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，利用有益微生物及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以有效地防治或減輕植物病害對(duì)農(nóng)作物的危害，具有保護(hù)生態(tài)環(huán)境和產(chǎn)品無(wú)農(nóng)藥殘留等優(yōu)點(diǎn)，為農(nóng)作物病害的生物防治實(shí)踐提供了有力支撐。

可用于植物病害防治的微生物種類(lèi)較多，包括真菌（如木霉菌）、放線菌、細(xì)菌以及病毒等。目前使用較成功的生防細(xì)菌主要為芽孢桿菌（Bacillus sp.）、假單胞桿菌（Pseudomonas sp.）、歐文菌（Erwinia sp.）。芽孢桿菌作為一類(lèi)大量存在于自然界的腐生細(xì)菌，具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、可以形成抗逆能力較強(qiáng)的芽孢等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域[1]。利用具有拮抗作用的芽孢桿菌防治病原菌是當(dāng)前生物防治植物病害的主要手段之一[2]。如從Solerotium rolfsti的溶裂菌絲中分離獲得的Bacillus subtilis A13菌株可以有效地在植物根部定殖，通過(guò)自身產(chǎn)生抗生素等功能抑制病原菌，同時(shí)該菌株能夠刺激植物生長(zhǎng)，比如可促進(jìn)胡蘿卜、燕麥和花生不同程度的增產(chǎn)，該菌株產(chǎn)品以商品QUANTUM-400作為花生處理劑銷(xiāo)售推廣[3]。在美國(guó)，GB03菌株用于防治由Rhizoctonia spp.和Fusarium spp.引起的病害，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，產(chǎn)品以商品Kodiak在美國(guó)和歐洲等地廣泛應(yīng)用[4]。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的增產(chǎn)菌也主要由Bacillus spp.組成，具有防病和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[5]。王金生等[6]分離得到的生防菌株Bacillus subtilis B1對(duì)于防治大白菜軟腐病和促進(jìn)增產(chǎn)有明顯的效果。

物理或化學(xué)誘變?cè)谔岣呱谰志钚约翱剐苑矫娴玫搅藦V泛的應(yīng)用。高菲等[7]采用紫外線和微波照射方法對(duì)出發(fā)菌株熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）GF-312進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得一株拮抗草莓腐霉病菌效果明顯優(yōu)于出發(fā)菌株的誘變菌株GF-16。向家云等[8]采用微波輻照，對(duì)檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）進(jìn)行誘變，選育到一株對(duì)柑橘青霉病抑菌活性較出發(fā)菌株提高了16.90%的突變株W50256。任濤濤等[9]利用He-Ne激光與氯化鋰復(fù)合誘變枯草芽孢桿菌WB3，篩選到對(duì)番茄灰霉病菌拮抗能力有顯著提高且穩(wěn)定性強(qiáng)的突變菌株L8。陳瑞勤[10]通過(guò)紫外線-亞硝酸復(fù)合誘變綠僵菌（Metarhizium anisopliae）M105-3，選育出孢子海藻糖含量顯著提高的誘變株，該誘變菌株的耐熱性、耐儲(chǔ)藏性及紫外線抗性有顯著提高，且遺傳性狀相對(duì)穩(wěn)定。

本研究對(duì)從土壤分離的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株經(jīng)UV-NaNO2復(fù)合誘變后獲得的突變菌株進(jìn)行了特征特性鑒定，并對(duì)其防治腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）的離體拮抗和盆栽效果進(jìn)行了測(cè)定，為開(kāi)發(fā)防治植物病害的生物制劑提供資源。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌從河北衡水溫室土壤中分離獲得。腐霉病菌由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 菌株的分離

稱取10 g從河北衡水市溫室內(nèi)采回的健康黃瓜植株根際土壤，用90 mL無(wú)菌水混勻，然后從中取1 mL用9 mL無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，重復(fù)進(jìn)行，最終成10-6、10-7、10-8 3個(gè)梯度菌懸液。移取3個(gè)梯度的菌懸液100 μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，根據(jù)菌落形態(tài)，挑取單菌落，劃線純化后4 ℃保藏，備用。

1.3 拮抗活性菌株的形態(tài)、生理生化特征測(cè)定及16S rDNA序列分析

形態(tài)及生理生化特征檢測(cè)參照參考文獻(xiàn)[11]。16S rDNA PCR擴(kuò)增參考成麗霞等[12]的方法，進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序，并利用DNAman軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 菌株誘變及篩選

采用UV-NaNO2復(fù)合誘變[13]。

吸取已制備的菌懸液10 mL（107 CFU/mL）于培養(yǎng)皿中，暗室30 W紫外線（UV）燈下30 cm處分別照射0、30、60、90、120、150、180 s；將1 mL 0.1 mol/L的NaNO2和1 mL分別經(jīng)不同時(shí)間UV照射的菌懸液與1 mL醋酸緩沖液在30 ℃水浴1、3、5、7、9 min，處理后加7 mL pH為8.6的Na2HPO4溶液終止反應(yīng)。取樣0.1 mL涂布LB平板，與未經(jīng)處理的菌懸液所涂平板對(duì)照進(jìn)行比較，計(jì)算致死率，選擇致死率為80%以下生長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。

致死率=（對(duì)照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)）/對(duì)照菌落數(shù)×100%。

1.5 拮抗活性菌株的篩選

采用平板對(duì)峙法篩選拮抗活性菌株，并測(cè)定菌株的抑菌率，選擇抑菌率值大的菌株進(jìn)行傳代，從中挑選遺傳性狀穩(wěn)定的菌株進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

抑菌率=（對(duì)照組病原菌的菌落直徑-試驗(yàn)組病原菌的菌落直徑）/對(duì)照組病原菌的菌落直徑×100%。

1.6 菌株對(duì)盆栽黃瓜腐霉病菌的防治效果測(cè)定

黃瓜種子經(jīng)雙氧水表面消毒，無(wú)菌水浸泡2 d，種植于滅菌的土壤中，待幼苗長(zhǎng)至4～5葉期時(shí)進(jìn)行防效試驗(yàn)。試驗(yàn)組每株黃瓜幼苗接種15 mL枯草芽孢桿菌菌懸液（孢子1×106個(gè)/mL）和15 mL黃瓜腐霉病菌孢子懸浮液（孢子1×106個(gè)/mL）；接種方式為將孢子懸浮液用注射器注入根圍土壤。對(duì)照組（CK）每株黃瓜幼苗接種15 mL超純水和15 mL黃瓜腐霉病菌孢子懸浮液（孢子1×106個(gè)/mL）；接種方式為將孢子懸浮液用注射器注入根圍土壤。接種孢子懸浮液20 d后調(diào)查發(fā)病率，對(duì)照CK計(jì)算病情指數(shù)。黃瓜腐霉病分級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1，試驗(yàn)重復(fù)3次，并采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

發(fā)病率=發(fā)病苗數(shù)/調(diào)查苗數(shù)×100%。

病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)病級(jí)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級(jí)值）。

防效=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.7 菌株耐高溫測(cè)試

液體培養(yǎng)基培養(yǎng)各菌株，將進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)液分別置于37、42、47 ℃的搖床中，220 r/min培養(yǎng)5 h，測(cè)定OD600 nm， 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

通過(guò)對(duì)根際土壤微生物的篩選，共獲得36株細(xì)菌菌株，其中8株為枯草芽孢桿菌菌株，經(jīng)平板對(duì)峙法篩選最終分離純化得到一株具拮抗作用的菌株D2。

2.2 D2菌株鑒定

菌株D2在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈不規(guī)則的不透明突起狀，粗糙有褶皺，褶皺有完整的膜，淡黃色，黏稠，圓形。革蘭氏染色為陽(yáng)性菌，生理生化特性見(jiàn)表2，該菌株能利用淀粉，接觸酶試驗(yàn)、明膠水解和卵磷脂水解為陽(yáng)性，能夠在6.5%NaCl溶液中生長(zhǎng)。以D2的基因組DNA為模板，用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.5 kb的16S rDNA片段，經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析顯示，該菌株與Bacillus subtilis同源性最高，利用DNAman構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1，該菌株與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系最近， 位于同一分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果，確定D2菌株為枯草芽孢桿菌。

2.3 D2菌株誘變

分別對(duì)紫外線照射及NaNO2處理D2菌株不同時(shí)間后的致死率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖2為菌株D2菌懸液受紫外線不同照射時(shí)間后的致死率變化情況。由圖2可知，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率上升，當(dāng)照射時(shí)間為60 s時(shí)，菌株的致死率超過(guò)60%，當(dāng)照射時(shí)間為140 s時(shí)其致死率接近100%。圖3為菌株D2菌懸液在NaNO2處理不同時(shí)間后的致死率。由圖3可知，當(dāng)處理時(shí)間300 s時(shí)，菌株的致死率超過(guò)80%，當(dāng)處理時(shí)間為360 s時(shí)其致死率接近100%。結(jié)合上述致死率變化情況，選取復(fù)合誘變時(shí)間為紫外線照射80 s，NaNO2處理300 s。

2.4 誘變菌株的篩選

對(duì)D2菌株進(jìn)行復(fù)合誘變之后共獲得了150多株單菌落菌株，對(duì)其進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，比較抑菌率值之后獲得4株相對(duì)D2原始菌株有較強(qiáng)抑菌能力的突變株，分別編號(hào)為D2-1、D2-2、D2-3、D2-4，其抑菌圈情況見(jiàn)表3。但是經(jīng)過(guò)10次傳代后，D2-3、D2-4均有不同程度的恢復(fù)，所以對(duì)D2-1和D2-2菌株進(jìn)行保存，并以D2-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 突變菌株的耐高溫性

通過(guò)對(duì)野生型和突變菌株進(jìn)行不同溫度下的生長(zhǎng)速率的測(cè)定（表4），發(fā)現(xiàn)野生型和突變菌株雖然都能在42 ℃下生長(zhǎng)；但在溫度高達(dá)47 ℃時(shí)，野生型幾乎不能生長(zhǎng)，而突變菌株的生長(zhǎng)速度明顯快于野生型。從而明確突變菌株的耐高溫性明顯強(qiáng)于野生型。

2.6 盆栽試驗(yàn)效果

溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，所有供試的枯草芽孢桿菌菌株均對(duì)腐霉病菌表現(xiàn)出良好的抑制作用，該菌對(duì)處理后的黃瓜幼苗生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，且能增加開(kāi)花數(shù)量，減輕發(fā)病率，降低病情指數(shù)。經(jīng)誘變篩選獲得的突變菌株D2-1較出發(fā)菌株D2對(duì)病原真菌具有更好的防治作用。

3 小結(jié)與討論

植物真菌病害是降低農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，長(zhǎng)期以來(lái)使用化學(xué)農(nóng)藥防治病害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到了十分重要的促進(jìn)作用，但是由于化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，已經(jīng)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)健康帶來(lái)較多負(fù)面作用，造成了人類(lèi)健康及生態(tài)平衡等一系列問(wèn)題，促使人們探尋一種更好的防治途徑，實(shí)施對(duì)人類(lèi)和環(huán)境無(wú)害并具良好防治效果的防治策略。隨著生物農(nóng)藥制劑的快速發(fā)展，微生物制劑已經(jīng)成為替代或減少化學(xué)農(nóng)藥使用的新型防治措施之一，受到學(xué)者、企業(yè)和消費(fèi)者的青睞。

目前，應(yīng)用較多的生防細(xì)菌是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）[14]，其對(duì)植物的有益作用主要表現(xiàn)在防病和刺激生長(zhǎng)兩個(gè)方面。對(duì)病害的防治機(jī)制包括拮抗、寄生、競(jìng)爭(zhēng)等多種方式，產(chǎn)生抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生細(xì)菌通過(guò)定殖于根系和優(yōu)先占領(lǐng)根系或抑制根上有害細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)從而達(dá)到防控作用。其中枯草芽孢桿菌是一種嗜溫性的好氧產(chǎn)芽孢革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，在土壤和植物的表面普遍存在，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害且不污染環(huán)境。由于它生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)分需求簡(jiǎn)單，易在植物的表面存活、定殖，而且其制劑的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，使用方便，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，因此是一種較為理想的生防微生物。

Bacillus subtilis是目前生物肥料和生防制劑應(yīng)用中最為廣泛的微生物菌種之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家的無(wú)公害農(nóng)業(yè)種植中得以廣泛的應(yīng)用。已研究表明，Bacillus subtilis所產(chǎn)抗菌物質(zhì)大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌[15]。而腐霉病菌作為重要的植物病原真菌之一，能夠引起農(nóng)作物腐爛、猝倒、生長(zhǎng)緩慢等癥狀，并且在苗期發(fā)病較為嚴(yán)重，造成大量死苗，從而影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量[16]。因此，篩選能夠高效防治腐霉病菌的Bacillus subtilis用于生物防治具有重要意義。

本研究分離到有拮抗作用的Bacillus subtilis D2菌株，并進(jìn)一步用NaNO2+UV誘變的方法獲得大量突變菌株，篩選得到2株較出發(fā)菌株更有效抑制腐霉病菌的突變菌株。對(duì)其中1株突變菌株進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變菌株的生長(zhǎng)速率較快，較短的培養(yǎng)時(shí)間就能積累較高產(chǎn)量的菌體，說(shuō)明其能較快定殖于根際，達(dá)到更好拮抗植物病菌的效果。突變菌株的耐高溫特性在生防微生物制劑生產(chǎn)和應(yīng)用中具有極為重要的價(jià)值，可以使微生物制劑對(duì)外界環(huán)境有更廣的適應(yīng)性，特別是適用于溫室大棚和夏季栽培的蔬菜和大田農(nóng)作物。本研究獲得了高效的Bacillus subtilis拮抗菌株，驗(yàn)證了用UV-NaNO2復(fù)合突變改造提高生防菌種的可能性和具體實(shí)施方案，為生物防治菌株的改造、篩選和利用提供了更有效的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬 欣，劉 俊，喬俊卿，等.利用轉(zhuǎn)座子TnYLB-1構(gòu)建枯草芽孢桿菌的突變體文庫(kù)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（6）：77-81.

[2] 劉 芳，薛鵬啟，喬俊卿，等.西藏低溫適生芽孢桿菌的分離鑒定及其抗菌和促生作用[J].中國(guó)生物防治，2010，26（4）：453-460.

[3] TURNER J T， BACKMAN P A. Factors relating to peanut yield increase after seed treat with Bacillus subtilis[J]. Plant Disease， 1991， 75： 347-353.

[4] EMMERT E A B， HANDELSMAN J. Biocontrol of plant disease： a（gram-） positive perapective[J]. FEMS Microbiology Letters， 1999， 171： 1-9.

[5] 梅汝鴻.增產(chǎn)菌[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989.

[6] 王金生，張學(xué)君.菜豐寧的研制原理與生產(chǎn)應(yīng)用[A].葉正楚.全國(guó)生物防治學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì)，1991.

[7] 高 菲，卜春亞，靳永勝，等.拮抗細(xì)菌GF-312的復(fù)合誘變選育[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（30）：254-258.

[8] 向家云，鄧伯勛，劉昱佳.微波誘變選育柑橘采后病害拮抗菌檸檬形克勒克酵母研究[J].微生物學(xué)雜志，2008，28（1）：8-11.

[9] 任濤濤，田永永，謝 云，等.提高拮抗菌WB3對(duì)番茄灰霉病菌拮抗能力的He-Ne激光與氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)[J].光子學(xué)報(bào)， 2011，40（3）：443-447.

[10] 陳瑞勤.紫外線-亞硝酸復(fù)合誘變選育高抗逆性綠僵菌的初步研究[J]. 河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25（2）：53-56.

[11] 坎布南R E，吉本斯N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第八版.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12] 成麗霞，彭 兵，李天金，等，一株具廣譜抗真菌活性細(xì)菌菌株的分離鑒定及拮抗物的理化特性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009（3）：365-370.

[13] 楊 堅(jiān)，孫永康，潘 科.冷泡茶發(fā)酵菌種的誘變育種[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：244-246.

[14] 紀(jì)明山，王英姿，程根武，等.西瓜枯萎病拮抗菌株篩選及田間防效試驗(yàn)[J].中國(guó)生物防治，2002，18（2）：71-74.

[15] 齊東梅.藥食源芽孢桿菌的分類(lèi)鑒定及枯草芽孢桿菌H110抑菌特性研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[16] 張 旭，尚 楠，張 寶，等.抗瓜果腐霉芽孢桿菌優(yōu)良菌株的篩選及生物學(xué)特性[J].食品科學(xué)，2012，33（5）：138-143.

（責(zé)任編輯 陳 焰）

目前，應(yīng)用較多的生防細(xì)菌是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）[14]，其對(duì)植物的有益作用主要表現(xiàn)在防病和刺激生長(zhǎng)兩個(gè)方面。對(duì)病害的防治機(jī)制包括拮抗、寄生、競(jìng)爭(zhēng)等多種方式，產(chǎn)生抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生細(xì)菌通過(guò)定殖于根系和優(yōu)先占領(lǐng)根系或抑制根上有害細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)從而達(dá)到防控作用。其中枯草芽孢桿菌是一種嗜溫性的好氧產(chǎn)芽孢革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，在土壤和植物的表面普遍存在，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害且不污染環(huán)境。由于它生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)分需求簡(jiǎn)單，易在植物的表面存活、定殖，而且其制劑的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，使用方便，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，因此是一種較為理想的生防微生物。

Bacillus subtilis是目前生物肥料和生防制劑應(yīng)用中最為廣泛的微生物菌種之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家的無(wú)公害農(nóng)業(yè)種植中得以廣泛的應(yīng)用。已研究表明，Bacillus subtilis所產(chǎn)抗菌物質(zhì)大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌[15]。而腐霉病菌作為重要的植物病原真菌之一，能夠引起農(nóng)作物腐爛、猝倒、生長(zhǎng)緩慢等癥狀，并且在苗期發(fā)病較為嚴(yán)重，造成大量死苗，從而影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量[16]。因此，篩選能夠高效防治腐霉病菌的Bacillus subtilis用于生物防治具有重要意義。

本研究分離到有拮抗作用的Bacillus subtilis D2菌株，并進(jìn)一步用NaNO2+UV誘變的方法獲得大量突變菌株，篩選得到2株較出發(fā)菌株更有效抑制腐霉病菌的突變菌株。對(duì)其中1株突變菌株進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變菌株的生長(zhǎng)速率較快，較短的培養(yǎng)時(shí)間就能積累較高產(chǎn)量的菌體，說(shuō)明其能較快定殖于根際，達(dá)到更好拮抗植物病菌的效果。突變菌株的耐高溫特性在生防微生物制劑生產(chǎn)和應(yīng)用中具有極為重要的價(jià)值，可以使微生物制劑對(duì)外界環(huán)境有更廣的適應(yīng)性，特別是適用于溫室大棚和夏季栽培的蔬菜和大田農(nóng)作物。本研究獲得了高效的Bacillus subtilis拮抗菌株，驗(yàn)證了用UV-NaNO2復(fù)合突變改造提高生防菌種的可能性和具體實(shí)施方案，為生物防治菌株的改造、篩選和利用提供了更有效的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬 欣，劉 俊，喬俊卿，等.利用轉(zhuǎn)座子TnYLB-1構(gòu)建枯草芽孢桿菌的突變體文庫(kù)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（6）：77-81.

[2] 劉 芳，薛鵬啟，喬俊卿，等.西藏低溫適生芽孢桿菌的分離鑒定及其抗菌和促生作用[J].中國(guó)生物防治，2010，26（4）：453-460.

[3] TURNER J T， BACKMAN P A. Factors relating to peanut yield increase after seed treat with Bacillus subtilis[J]. Plant Disease， 1991， 75： 347-353.

[4] EMMERT E A B， HANDELSMAN J. Biocontrol of plant disease： a（gram-） positive perapective[J]. FEMS Microbiology Letters， 1999， 171： 1-9.

[5] 梅汝鴻.增產(chǎn)菌[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989.

[6] 王金生，張學(xué)君.菜豐寧的研制原理與生產(chǎn)應(yīng)用[A].葉正楚.全國(guó)生物防治學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì)，1991.

[7] 高 菲，卜春亞，靳永勝，等.拮抗細(xì)菌GF-312的復(fù)合誘變選育[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（30）：254-258.

[8] 向家云，鄧伯勛，劉昱佳.微波誘變選育柑橘采后病害拮抗菌檸檬形克勒克酵母研究[J].微生物學(xué)雜志，2008，28（1）：8-11.

[9] 任濤濤，田永永，謝 云，等.提高拮抗菌WB3對(duì)番茄灰霉病菌拮抗能力的He-Ne激光與氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)[J].光子學(xué)報(bào)， 2011，40（3）：443-447.

[10] 陳瑞勤.紫外線-亞硝酸復(fù)合誘變選育高抗逆性綠僵菌的初步研究[J]. 河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25（2）：53-56.

[11] 坎布南R E，吉本斯N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第八版.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12] 成麗霞，彭 兵，李天金，等，一株具廣譜抗真菌活性細(xì)菌菌株的分離鑒定及拮抗物的理化特性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009（3）：365-370.

[13] 楊 堅(jiān)，孫永康，潘 科.冷泡茶發(fā)酵菌種的誘變育種[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：244-246.

[14] 紀(jì)明山，王英姿，程根武，等.西瓜枯萎病拮抗菌株篩選及田間防效試驗(yàn)[J].中國(guó)生物防治，2002，18（2）：71-74.

[15] 齊東梅.藥食源芽孢桿菌的分類(lèi)鑒定及枯草芽孢桿菌H110抑菌特性研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[16] 張 旭，尚 楠，張 寶，等.抗瓜果腐霉芽孢桿菌優(yōu)良菌株的篩選及生物學(xué)特性[J].食品科學(xué)，2012，33（5）：138-143.

（責(zé)任編輯 陳 焰）

目前，應(yīng)用較多的生防細(xì)菌是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）[14]，其對(duì)植物的有益作用主要表現(xiàn)在防病和刺激生長(zhǎng)兩個(gè)方面。對(duì)病害的防治機(jī)制包括拮抗、寄生、競(jìng)爭(zhēng)等多種方式，產(chǎn)生抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生細(xì)菌通過(guò)定殖于根系和優(yōu)先占領(lǐng)根系或抑制根上有害細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)從而達(dá)到防控作用。其中枯草芽孢桿菌是一種嗜溫性的好氧產(chǎn)芽孢革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，在土壤和植物的表面普遍存在，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害且不污染環(huán)境。由于它生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)分需求簡(jiǎn)單，易在植物的表面存活、定殖，而且其制劑的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，使用方便，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，因此是一種較為理想的生防微生物。

Bacillus subtilis是目前生物肥料和生防制劑應(yīng)用中最為廣泛的微生物菌種之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家的無(wú)公害農(nóng)業(yè)種植中得以廣泛的應(yīng)用。已研究表明，Bacillus subtilis所產(chǎn)抗菌物質(zhì)大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌[15]。而腐霉病菌作為重要的植物病原真菌之一，能夠引起農(nóng)作物腐爛、猝倒、生長(zhǎng)緩慢等癥狀，并且在苗期發(fā)病較為嚴(yán)重，造成大量死苗，從而影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量[16]。因此，篩選能夠高效防治腐霉病菌的Bacillus subtilis用于生物防治具有重要意義。

本研究分離到有拮抗作用的Bacillus subtilis D2菌株，并進(jìn)一步用NaNO2+UV誘變的方法獲得大量突變菌株，篩選得到2株較出發(fā)菌株更有效抑制腐霉病菌的突變菌株。對(duì)其中1株突變菌株進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變菌株的生長(zhǎng)速率較快，較短的培養(yǎng)時(shí)間就能積累較高產(chǎn)量的菌體，說(shuō)明其能較快定殖于根際，達(dá)到更好拮抗植物病菌的效果。突變菌株的耐高溫特性在生防微生物制劑生產(chǎn)和應(yīng)用中具有極為重要的價(jià)值，可以使微生物制劑對(duì)外界環(huán)境有更廣的適應(yīng)性，特別是適用于溫室大棚和夏季栽培的蔬菜和大田農(nóng)作物。本研究獲得了高效的Bacillus subtilis拮抗菌株，驗(yàn)證了用UV-NaNO2復(fù)合突變改造提高生防菌種的可能性和具體實(shí)施方案，為生物防治菌株的改造、篩選和利用提供了更有效的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬 欣，劉 俊，喬俊卿，等.利用轉(zhuǎn)座子TnYLB-1構(gòu)建枯草芽孢桿菌的突變體文庫(kù)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（6）：77-81.

[2] 劉 芳，薛鵬啟，喬俊卿，等.西藏低溫適生芽孢桿菌的分離鑒定及其抗菌和促生作用[J].中國(guó)生物防治，2010，26（4）：453-460.

[3] TURNER J T， BACKMAN P A. Factors relating to peanut yield increase after seed treat with Bacillus subtilis[J]. Plant Disease， 1991， 75： 347-353.

[4] EMMERT E A B， HANDELSMAN J. Biocontrol of plant disease： a（gram-） positive perapective[J]. FEMS Microbiology Letters， 1999， 171： 1-9.

[5] 梅汝鴻.增產(chǎn)菌[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989.

[6] 王金生，張學(xué)君.菜豐寧的研制原理與生產(chǎn)應(yīng)用[A].葉正楚.全國(guó)生物防治學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì)，1991.

[7] 高 菲，卜春亞，靳永勝，等.拮抗細(xì)菌GF-312的復(fù)合誘變選育[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（30）：254-258.

[8] 向家云，鄧伯勛，劉昱佳.微波誘變選育柑橘采后病害拮抗菌檸檬形克勒克酵母研究[J].微生物學(xué)雜志，2008，28（1）：8-11.

[9] 任濤濤，田永永，謝 云，等.提高拮抗菌WB3對(duì)番茄灰霉病菌拮抗能力的He-Ne激光與氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)[J].光子學(xué)報(bào)， 2011，40（3）：443-447.

[10] 陳瑞勤.紫外線-亞硝酸復(fù)合誘變選育高抗逆性綠僵菌的初步研究[J]. 河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25（2）：53-56.

[11] 坎布南R E，吉本斯N E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第八版.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

[12] 成麗霞，彭 兵，李天金，等，一株具廣譜抗真菌活性細(xì)菌菌株的分離鑒定及拮抗物的理化特性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009（3）：365-370.

[13] 楊 堅(jiān)，孫永康，潘 科.冷泡茶發(fā)酵菌種的誘變育種[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：244-246.

[14] 紀(jì)明山，王英姿，程根武，等.西瓜枯萎病拮抗菌株篩選及田間防效試驗(yàn)[J].中國(guó)生物防治，2002，18（2）：71-74.

[15] 齊東梅.藥食源芽孢桿菌的分類(lèi)鑒定及枯草芽孢桿菌H110抑菌特性研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[16] 張 旭，尚 楠，張 寶，等.抗瓜果腐霉芽孢桿菌優(yōu)良菌株的篩選及生物學(xué)特性[J].食品科學(xué)，2012，33（5）：138-143.

（責(zé)任編輯 陳 焰）